Разработка методики количественного определения флавоноидов в листьях urtica dioica

АННОТАЦИЯ

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях крапивы двудомной с использованием спектрофотометрического метода. Объектом исследования служили воздушно-сухие измельченные листья крапивы двудомной заготовленные в фазе массового цветения в Южно-Казахстанской области. Определение содержания флавоноидов в листьях лекарственного растения проведено по разработанной нами методике спектрофотометрического метода СФ 2000 (Россия).

Разработана методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

Ключевые слова: флавоноиды, экстракция, количественное определение, листья крапивы двудомной, спектрофотометрический метод.

Введение. В последние годы возрос интерес к изучению дикорастущих растений, как к источнику ценного сырья для получения новых эффективных лекарственных средств. Одним из самых широко используемых лекарственных растений, как в народной, так и в научной медицине при различных заболеваниях является крапива двудомная. Крапива двудомная имеет обширную сырьевую базу на территории южного Казахстана и может служить доступным источником для получения фитопрепаратов. Это очень важно, в настоящее время когда решается вопрос о расширении ассортимента собственного фармацевтического производства. По литературным данным, в листьях крапивы содержатся витамин К, флавоноиды, дубильные вещества, танины, фитонциды, органические кислоты, хлорофилл, гликозиды и другие. Листья крапивы применяются в научной медицине как кровоостанавливающее средство и в народной медицине как гепатопротекторное, капилляроукрепляющее, желчегонное и мочегонное средство [1-5].

Листья крапивы являются официальным растительным сырьем, включенным в ГФ XI изд. Количественное определение на действующее вещество в НД не приводится. В ГФ РК приводится фармакопейная статья на листья крапивы двудомной и рекомендуется определение содержания кислоты кофеилмалоновой и кислоты хлорогеновой в пересчете на кислоту хлорогеновую методом жидкостной хроматографии [6].

Известно, что оксикоричные кислоты являются фенольными соединениями С6 — С3-ряда, у которых бензольное кольцо связано с карбоксильной группой через этиленовую связь. Оксикоричные кислоты встречаются практически у всех высших растений. Наиболее широко распространена кофейная кислота. Она часто образует димеры с алициклическими кислотами (хинной и шикимовой). Наиболее известны 3-кофеил-хинная кислота (хлорогеновая) и её изомеры. Но из-за недоступности стандартного образца хлорогеновой кислоты перед нами стояла изучить накопление основных биологически активных соединений в растении в условиях данного региона и предложить стандартизацию сырья по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

Целью исследования является разработка методики количественного определения суммы флавоноидов (ФВ) в пересчете на рутин в листьях крапивы двудомной (КД) с использованием спектрофотометрического метода.

Материалы и методы. Объектом исследования служили воздушно-сухие измельченные листья КД заготовленные в фазе массового цветения в Южно-Казахстанской области. В исследованиях использован спектрофотометр СФ 2000 (ОКБ "Спектр", Россия); измерения проводили в диапазоне длин волн 400-760 нм, в кюветах с толщиной слоя 10 мм. В анализе использованы реактивы и растворители квалификации «ч.д.а.».

Методика количественного определения флавоноидов. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл и добавляют 100 мл спирта этилового 96%, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане при температуре 80-85^о С в течение 30 мин. Извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный спиртом этиловым 96%, в мерную колбу вместимостью 250 мл. Твердый остаток (каждый раз вместе с фильтром) еще трижды экстрагируют спиртом этиловым 96% порциями по 50 мл в аналогичных условиях (кипение растворителя, 30 мин), каждый раз извлечение фильтруют в одну и ту же колбу. Объем раствора доводят спиртом этиловым 96% до метки и перемешивают (раствор А).

5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 6 мл раствора алюминия хлорида спиртового 2%, помещают на 3 мин в кипящую водяную баню, быстро охлаждают, прибавляют 4 капли кислоты хлороводородной разведенной, доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки и перемешивают (раствор Б).

Через 40 мин измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 411±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 5 мл раствора А, 4 капли кислоты хлороводородной разведенной, доведенный спиртом этиловым 96% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность РСО рутина с хлоридом алюминия.

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл РСО рутина, прибавляют 1 мл раствора алюминия хлорида 2%, прибавляют 4 капли кислоты хлороводородной разведенной, доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки и перемешивают.

В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 1 мл раствора РСО рутина, 4 капли кислоты хлороводородной разведенной, доведенный спиртом этиловым 96% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье в пересчете на безводный рутин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D₁ х 250 х 25 х m0 х (IOO-W_o) х 100

X=

D_t^ m х 5 х 100 х 25 х (100-W)

где D₁ - оптическая плотность раствора Б;

D_o - оптическая плотность РСО рутина с хлоридом алюминия ;

m - масса сырья, г;

то- навеска РСО рутина, г;

W_o- содержание влаги в РСО по К. Фишеру, % W -влажность сырья, %.

Приготовление раствора РСО рутина. Около 0,007 г ( точная навеска) РСО рутина (ГФ РК, 1075300 [153-18-4] ), высушенного при 130-140⁰ С, растворяют при нагревании на водяной бане в 80 мл спирта этилового 96% в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора тем же растворителем после охлаждения до метки. Срок годности раствора 1 мес.

Приготовление раствора алюминия хлорида спиртового 2%.2 г алюминия хлорида (ГФ РК, 1002700 [7784-13-6] ) растворяют в 80 мл спирта этилового 96% в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки тем же растворителем, перемешивают. Срок годности раствора 1 месяц при хранении в хорошо укупоренной таре.

Результаты количественного определения суммы ФВ в листьях КД в таблице 1.

Результаты и обсуждения. Количественное определение суммы ФВ в листьях КД проведено спектрофотометрическим методом в видимой области спектра. В основе методики лежит реакция ФВ со спиртовым раствором алюминия хлорида в присутствии кислоты хлороводородной разведенной. Из литературы известно, что реакция ФВ со спиртовым раствором алюминия хлорида проводится в присутствии раствора кислоты уксусной разведенной [7]. Согласно нашим экспериментальным данным, для получения наиболее стабильных результатов, оптимальной средой для комплексообразования явилась кислота хлороводородная разведенная.

В качестве РСО использован рутин. Оптимальные условия экстракции суммы ФВ из листьев КД определяли на одном образце сырья. Изучено влияние различных условий экстрагирования сырья (измельченность, время экстракции, соотношение сырья и экстрагента и концентрация спирта) на выход ФВ и установлены параметры комплексообразования: оптимальная концентрация спиртового раствора алюминия хлорида, количество добавляемого алюминия хлорида, время образования и устойчивость комплекса. Использованы различные концентрации спиртового раствора алюминия хлорида: 2%, 4%, 6%, 8%, 10%. Наиболее оптимальным оказался раствор алюминия хлорида спиртовый 2%, при этом реакция комплексообразования развивается в течение 40 мин и сохраняется стабильность комплекса в течение последующих 40 мин.

Для установления зависимости оптической плотности от концентрации раствора рутина был построен калибровочный график. Калибровочная кривая зависимости между оптической плотностью и концентрацией продуктов взаимодействия рутина с алюминия хлоридом в кислой среде носит линейный характер в интервале от 0,0002 до 0,0004%. Наименьшее определяемое количество ФВ 0,003 мг/мл. Спектры поглощения комплекса рутина со спиртовым раствором алюминия хлоридом и очищенного извлечения из листьев КД со спиртовым раствором алюминия хлоридом в кислой среде совпадают. Максимум поглощения спектров наблюдается при длине волны 411±2 нм. Влияние условий экстракции на выход ФВ из листьев КД (среднее значение из 5 определении серии образцов) представлено в таблице 1.

Исходя из данных таблицы 1 видно, что оптимальное извлечение достигается при использовании в качестве экстрагента спирта этилового 96%, при измельченности сырья до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, при условии экстракции - нагревание на кипящей водяной бане в течение 30 мин, при соотношении сырья и экстрагента 1:250. Исследования показали, что при использовании метода четырехкратной экстракции (100 мл спирта этилового 96% - нагревание 30 мин, три раза по 50 мл спирта этилового 96% - нагревание 30 мин) извлечение из сырья ФВ происходит полностью.

Как видно из таблицы 2, оптимальное количество раствора алюминия хлорида спиртового 2%, обеспечивающего полноту образования комплекса, составляет 6 мл.

Таблица 2- Количество раствора алюминия хлорида спиртового 2%, обеспечивающего полноту образования комплекса

54

По разработанной нами методике проведено количественного определения суммы ФВ в листьях КД. Результаты исследования приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты количественного определения суммы флавоноидов в листьях крапивы двудомной

Как видно из данных таблицы 3, исследованное сырье содержит 0,38-0,90%, не менее 0,38±2,10% суммы ФВ в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье. Полученные результаты укладываются в норму допустимых отклонений для спектрофотометрического метода, при доверительной вероятности 0,95 не превышает 5%.

Таким образом, нами разработана методика количественного определения суммы ФВ в листьях крапивы двудомной в пересчете на рутин спетрофотометрическим методом.

Выводы. Разработана методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в видимой области спектра. По разработанной методике проведено количественное определение суммы флавоноидов в листьях крапивы двудомной.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. К.Д. Рахимов, Ж.А. Сатыбалдиева, Г.С. Суходоева и др. Руководство по работе с лекарственными растениями / Под ред. Н.Д. Беклемишева. - Алматы: РГКП «Дәрі-Дармек», 1999. - 232с.
2. Лагерь А.А. Лечение растениями.- Красноярск: Алис, 1992.-166с.
3. Яковлев Г.П., Блинов К.Ф. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: уч. пособие.- СПб.: СпецЛИТ, 2004.- 765 с.
4. Алиев Е.Т., Нурханова Г.Ж., Турсубекова Б.И. Идентификация рутина в листьях крапивы двудомной методом тонкослойной хроматографии. ЮКГФА, г. Шымкент. Вестник ЮКГФА. 2013.C14-16.
5. Дурмишиадзе С.В. Флаваноиды и оксикоричные кислоты некоторых представителей дикорастущей флоры Грузии/ С.В. Дурмишиадзе-Тбилиси: Мецниереба, 1981. - 196с.
6. Қазақстан Республикасы мемлекеттік фармакопеясы.-Алматы: «Жібек жолы» баспа үйі.-2014.- Том 3.-754 б.
7. Тринеева О.В., Сливкин А.И., Воропаева С.С. Разработка и валидация методики количественного определения флавоноидов в листьях крапивы двудомной./Вестник ВГУ, серия: химия, биология, фармация, 2014. №1. С.138-140.