В последнее время исследования, связанные с получением заменителей сычужного фермента, являются актуальной проблемой современной биотехнологии. Замена общепризнанного, но дорогостоящего сычужного фермента грибными протеазами узкого специфического действия, представляется экономически выгодной и перспективной задачей сыроделия. И хотя на сегодня известно довольно большое количество продуцентов ферментов сычужного действия, их поиск продолжается (Гудков, 2004.).
Исследования посвящены изучению способности штамма Ff-14 Fomes fomentarius к синтезу протеиназ молокосвертывающего действия.
Объектом исследования являлась культура Ff-14 Fomes fomentarius,полученная и9з плодового тела гриба Fomes fomentarius, произроставшего на тополе в г. Донецке(Украина). Культуру выращивали в течении 25 суток на глюкозо-пептонной среде следующего состава (г/л): глюкоза-10, пептон-3, MgSO4- 0.5, CaCl2-0.05, KH2PO4-0.6, K2HPO4-0.4, ZnSO4-0.001, дистиллированная вода до 1 л. рН питательной среды доводили до значения 4.5 при помощи 10% HCl (Низовская, Федорова и Дроздова, 1979), при температуре 26 С. Молокосвертывающую активность (МСА) культурального фильтрата, накопление биомассы и изменение кислотности среды регистрировали на 5,10,15,20 и 25-е сутки роста продуцента.
Определение молокосвертывающей активности (МСА) культурального фильтрата гриба осуществляли методом Kawai и Mukai (Белки,ферменты и стерины базидиальных грибов,(методы исследования) Л.:Наука, 1979; Бойко, 2002). Для определения активности молокосвертывающего фермента в качестве субстрата использовали свежее молоко "Добрыня" ТМ Геркулес. К каждым 100мл
молока прибавляли 1мл 15% раствора CaCl2 и доводили до значения pH - 6.0. Молоко в объеме 10 мл выдерживали при t=35°C в течении 5 минут на водяной бане, затем в пробирку добавляли 1мл культурального фильтрата. О степени активности фермента судили по времени свертывания молока в
минутах. Время, необходимое для образования плотного сгустка молока, определяли секундомером.
Расчет МСА вели в условных единицах. За единицу МСА принимали такое количество фермента,
которое свертывает 100мл молока за 40 минут при 35°C (Типограф,Петина,1966). МСА рассчитывали
по формуле: МСАКФ=
40Х100ХК
П
, ед/мл, где: К - коэффициент разведения культурального фильтрата; П -
время, за которое при прибавлении культурального фильтрата к 100 мл молока образуется плотный
сгусток, мин; 40 - среднее время свертывания молока при производстве сыра, мин. Накопление биомассы определяли весовым методом (Петербургский,1968). Кислотность культурального фильтрата измеряли потенциометрическим методом на анализаторе ионов А1-123(Украина).
Содержание белка в культуральной жидкости определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46, ЛОМО (Россия) (Кочетов,1989). Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана и тирозина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при длине волны 280 нм. Для того, чтобы избежать влияния присутствия нуклеиновых кислот и нуклеотидов, оптическую плотность измеряли не только при 280 нм, но и при 260 нм, а истинное содержание белка рассчитывали по формуле: Сб= 1.55хА280 - 0.76хА260, где: Сб - концентрация белка, мг/мл; А280 и А260 - оптическая плотность, измеренная при длине 280 и 260 нм соответственно (Дарбре,1989).
Опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием параметрических (дисперсионный анализ, множественное сравнение средних арифметических по критериям Дункана) методов анализа статистических выборок (Приседский, 1999).
Установлен что,максимальное значение молокосвертывающей активности культурального фильтрата штамма Ff-14 Fomes fomentarius зафиксировано в период с 15 по 25-е сутки роста и составило 108 ед/мл и динамика удельной молокосвертывающей активности совпадала с динамикой общей молокосвертывающей активности. Удельная МСА находилась примерно на одном уровне и составляла 50.75 ед/мг белка. Наибольшее накопление белка наблюдалось в период с 15 по 25-е сутки и держалось приблизительно на одном уровне 2.2 мг/мл, однако максимум был зарегистрирован на 20 сутки, который составлял 2.4 мг/мл. Средний показатель рН в ходе эксперимента составлял 4.5, однако в дальнейшем уровень рН сильно варьировал. Это связано со способностью гриба использовать те или иные компоненты питательной среды и образовывать различные экзоферменты. Максимальное значение накопления биомассы штаммом Ff-14 Fomes fomentarius установлено на 25 сутки роста продуцента и составило 4.294 г/л.
Таким образом,полученные результаты свидетельствуют о том, что штамм Ff-14 Fomes fomentarius (L.) Fr. способен к синтезу ферментов молокосвертывающего (сычужного) дествия и требует дальнейших, более глубоких исследований по оптимизации условий его культивирования с целью повышения ферментативной активности.
