АННОТАЦИЯ
Невынашивание у женщин с перегородкой матки представляет собой проблему, которая может быть связана как с наличием самой перегородки, так и с системными метаболическими, гормональными особенностями организма женщины. Поэтому представляет интерес исследование показателей функционального состояния эндометрия женщин с подобным типом нарушений, а также состояния различных участков децидуальной оболочки, получаемой у женщин в момент самопроизвольного аборта.
Ключевые слова: внутриматочная перегородка, невынашивание беременности, ангиогенные факторы, металлопротеиназы.
Целью настоящей работы было исследование экспрессии эндотелиальный фактор роста (VEGF), представляющий собой индуктор ангиогенеза, и его рецептора Flt-1 (VEGFR-1), а также экспрессию матричных металлопротеиназ (MT-MMP -2 и MT-MMP -5) в ткани децидуальной оболочки женщин с внутриматочной перегородкой и привычным невынашиванием. При этом исследования проводились в образцах децидуцального секретирующего эндометрия (ДСЭ), париетальной децидуальной оболочке (ПД), а также в базальной децидуальной оболочке (БД).
Материалы и методы. В работе наблюдали 15 женщин с внутриматочной перегородкой и 12 - практически здоровых. Образцы децидуальной оболочки получали с помощью вакуум-аспирации при проведении абортов (в группе контроля) и при произвольном прерывании беременности в основной группе. Прерывание беременности при спонтанном аборте верифицировали с помощью УЗ-исследования. Аспирированные ткани анализировали на предмет отсутствия патологических изменений и при наличии последних, не включали в исследование.
Образцы децидуальной оболочки, получаемые из вакуумного аспирата, фиксировали в формалине и затем парафинизировали. В последующем поводили окрашивание с помощью гематоксилин-флоксин- сафрана. Гематоксилин (50 г калий-алюминиевого сульфата, 1 г гематоксилина, 500 мг лимонной кислоты, 25 г хлоралгидрата, 200 мг NaJO3 в 1000 мл дистиллированной воды) окрашивал ядра клеток и в фиолетовопурпурный цвет; флоксин (0,25 г флоксина в 100 мл дистиллировнной воды) окрашивал цитоплазму клеток в розовый цвет; сафранин (3 г сафранина в 1000 мл 100% алкоголя) применяли для окрашивания коллагеновых волокон в оранжево-желтый цвет. Подобное окрашивание позволяло дифференцировать децидуальную оболочку и секреторную ее части - ДСЭ, которая при микроскопии напоминала секреторный эндометрий. БД и ПД различали на основании наличия или отсутствия неворсинчатого трофобласта при использовании анти - цитокератинового окрашивания. В наблюдении анализировали результаты, полученные у женщин с точной верификацией всех компонентов децидуальной оболочки.
Перед проведением иммуногистохимических исследований срезы депарафинизировали, эндогенную пероксидазу инактивировали с помощью 3% раствора перекиси водорода и метанола, а неспецифическое связывание подавляли путем инкубации срезов с 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA). Обработку трипсином применяли для определения MT2- и MT5-MMP. В исследовании применяли первичные анти MT1-MMP поликлональные кроличьи антитела. Вторичные антитела были представлены: биотинилированные лошадиные анти-мышиные антитела (разведение 1:300, BA-2000, Vector, США), биотинилированные ослиные анти-кроличьи антитела (1:300, RPN1004, Amersham Biosciences) и биотинилированные кроличьи анти-козьи антитела (1:300, E-0466, DakoCytomation, США). Образцы инкубировали с первичными антителами при 48о C в течение ночи, после чего в течение часа инкубировали со вторичными биотинилированными антителами. Связывание антител верифицировали с помощью стрептавидина в комплексе с биотинилированной пероксидазой (K0377, DakoCytomation, Glostrup, Дания) и NovaRED TM субстрата (SK- 4800, Vector, США) в соотвествие с протоколом производителя.
Срезы окрашивали гематоксилином Майера. Иммуногистохимическое окрашивание оценивали путем определения индекса окрашивания (ИО): пропорцию окрашенных клеток умножали на интенсивность окрашивания. При этом пропорцию окрашенных клеток представляли в виде дискретных величин - 0, 1, 2 или 3, что соответствовало окрашиванию (присутствию антигена в клетках) соответственно в 0; 10; 10-50 и у 50% клеток по отношению к общему их числу, принятому за 100%. ИО выражали по трехбалльной шкале, приняв за 1 балл- слабое, 2-средней степени выраженности и 3- интенсивное окрашивание. Таким образом, минимальная величина рассчитываемого показателя составлял «0», а максимальная - «9». Для оценки принимали среднее значение ИО, определяемое по результатам соответствующих измерений двумя независимыми экспертами и обрабатывали статистически с применением общепринятых в медикобиологических исследованиях критериев оценки различий.
Результаты исследования. Сравнение общей экспрессии (общий ИО) исследованных антигенов в ПД, ДСЭ и БД группы контроля показало большую общую экспрессию Flt-1 и MT2-MMP в БД- в 1,5 и в 1,8 раза соответственно (P<0.05). Экспрессия антигенов была наиболее высокой в секреторных эпителиальных клетках, и снижалась в ряду - периваскулярные гладкомышечные клетки и стромальные клетки. В эндотелии были экспрессированы все ангиогенные факторы, за исключением MT5-MMP. Эндотелиальная экспрессия Flt-1 была различной в исследованных трех участках децидуальной оболочки и MT2-MMP был менее экспрессирован в БД по сравнению с ПД и ДСЭ. Все ангиогенные факторы, за исключением слабо экспрессированного MT5-MMP, также обнаруживались в ворсинках трофобласта; VEGF и Flt-1 имели при этом средний уровень экспрессии.
У пациенток с невынашиванием установлено повышение общего ИО MT5-MMP - в 1,7 раза (P<0.05), увеличение общей экспрессии Flt-1 - в 2,1 раза (P<0.05). Кроме того, отмечалась редукция общей
экспрессии MT5-MMP в 1,5 раза (P<0.05). Кроме того, ангиогенные факторы в БД имели различную экспрессию; общий ИО Flt-1 возрастал в БД женщин с невынашиванием в 1,8 раза (P<0.05), что особенно проявлялось в периваскулярных гладкомышечных и стромальных клетках. Кроме того, в БД у женщин с привычным абортом была увеличена общая экспрессия MT2- и MT5-MMP - в 1,6 и в 2,0 раза (P<0.05). Эндотелиальная экспрессия Flt-1, MT2- и MT5-MMP также были увеличены в сравнении с показателями в контроле - в 1,5-1,7 раз (P<0.05).
Выводы. Полученные результаты показали, что у женщин с внутриматочной перегородкой, у которых наблюдается привычное невынашивание, отмечаются изменения экспрессии факторов ангиогенеза и протеиназной активности в различных участках децидуальной оболочки: увеличение экспрессии антигенов Flt1, MT2- и MT5-MMP в участках париетальной и базальной децидуальной оболочки. Подобные различия могут обусловливать различия метаболизма и лежать в основе развития бесплодия и невынашиваня.