Микробные экзополисахариды (ЭПС) - локализированные снаружи клетки углеводные полимеры, которые благодаря своим физико-химическим свойствам широко применяются в различных отраслях промышленности [5]. На сегодняшний день для их получения, в основном, используется дорогое углеводное сырье [2]. Ввиду того, что стоимость источника углерода и энергии может составлять до половины себестоимости продуктов микробного синтеза, во всем мире ведется активный поиск альтернативных дешевых субстратов для биосинтеза полисахаридов.
Одним из преимуществ микробного ЭПС этаполана (продуцент Acinetobacter sp. ИМВ В-7005), по сравнению с известными в мире полисахаридами, является возможность его получения на широком наборе различных С2-С6-субстратов (углеводы, этанол, ацетат, органические кислоты), а также на рафинированном и отработанном маслах [4, 5]. Ранее в обзоре [2] мы отмечали, что в литературе имеются лишь отдельные работы по получению ЭПС на маслосодержащих субстратах.
Одним из подходов для интенсификации технологий микробного синтеза является использование смеси ростовых субстратов. В предыдущих работах [5] показана возможность интенсификации биосинтеза этаполана на смеси энергетически-неравноценных (этанол и глюкоза, фумарат и глюкоза) и энергетически-дефицитных субстратах (ацетат и глюкоза). Последующие исследования позволили заменить глюкозу в смешанных С2-С6-субстратах на мелассу - побочный продукт производства сахара.
Культивирование микроорганизмов на смеси ростовых субстратов позволяет избежать непродуктивных потерь углерода и энергии, имеющих место при использовании моносубстратов, а также повысить эффективность трансформации субстратов в биомассу и вторичные метаболиты [1, 5]. Такой эффект в полной мере достигается при оптимальном молярном соотношении моносубстратов в смеси. Для его определения необходимо: 1) рассчитать энергетические потребности синтеза биомассы и ЭПС на энергетически-дефицитном субстрате; 2) определить концентрацию энергетически-избыточного субстрата, восполняющую потери углерода энергетически-дефицитного субстрата при окислении его до СО2 с целью получения энергии, необходимой для процессов конструктивного метаболизма [5]. В дальнейшем оптимальное молярное соотношение моносубстратов подтверждается экспериментальными исследованиями.
В связи с изложенным выше, цель данной работы - определить условия культивирования Acinetobacter sp. ИМВ В-7005, обеспечивающие максимальные показатели синтеза микробного полисахарида этаполана на смеси мелассы и подсолнечного масла.
Штамм ИМВ В-7005 культивировали в жидкой минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода смесь мелассы (1,0-2,0 %, по углеводам) и рафинированного подсолнечного масла (0,4-2,0 %, по объему). Посевной материал выращивали в среде с мелассой (0,5 %) и маслом (0,5 %).
Культивирование осуществляли в колбах (750 мл) с 100 мл среды на качалке (320 об/мин) при 30 0C в течение 120 ч.
Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности клеточной суспензии с последующим пересчетом на сухую биомассу в соответствии с калибровочным графиком. Синтез этаполана оценивали по концентрации ЭПС, которую определяли весовым методом. Для этого к определенному объему культуральной жидкости (10-15 мл) добавляли 1,2-2 объема изопропилового спирта, полученный осадок ЭПС промывали чистым изопропанолом и высушивали при комнатной температуре в течение 24 часов. ЭПС-синтезирующую способность определяли как отношение концентрации ЭПС к концентрации биомассы и выражали в г ЭПС/г биомассы.
Теоретической основой для проведения расчетов была концепция вспомогательного субстрата, разработанная Бабелем в 80-хх годах ХХ ст. [1]. Энергетические потребности на синтез этаполана из сахарозы определяли, как описано в работе [5]. Генерацию энергии при катаболизме линолевой и олеиновой жирных кислот рассчитывали на основе информации о в—окисленнии жирных кислот [3], а также на основе данных об активности ферментов цикла Кребса, глиоксилатного цикла и глюконеогенеза у Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 [5].
На основе теоретических расчетов затрат энергии на синтез этаполана в биомассе установлено, что оптимальное молярное соотношение концентраций энергетически дефицитного (сахароза) и избыточного (подсолнечное масло) субстратов в смеси составляет 1:0,9. Дальнейшие эксперименты показали, что максимальные показатели синтеза ЭПС наблюдались при молярном соотношении моносубстратов в смеси 1:1,1, наиболее приближенном к теоретически рассчитанному.
В дальнейшем было установлено, что концентрация ЭПС и ЭПС-синтезирующая способность зависели от концентрации моносубтратов в смеси и природы источника углерода при получении посевного материала. Так, повышение концентрации мелассы и масла в смеси с 1,0 до 1,5 % (при оптимальном молярном соотношении) сопровождалось увеличением количества синтезированного этаполана и ЭПС-синтезирующей способности в 1,2 и 1,3 раза соответственно. При замене масла в среде для получения инокулята на мелассу наблюдалось увеличение концентрации ЭПС с 10 до 12,3 г/л.
Таким образом, в результате проведенной работы определены оптимальные условия, обеспечивающие максимальные показатели синтеза ЭПС на смеси мелассы и рафинированного масла.
Литература
- Babel W., Muller R.H. Mixed substrate utilization in microorganisms: biochemical aspects and energetics // J. Gen. Microbiol. - 1985. - V. 131, № 1. - P. 39-45.
- Pirog T.P., Ivakhniuk M.O., Voronenko A.A. Exopolysaccharides synthesis on industrial waste // Biotechnologia Acta. - 2016. - V. 9, № 2. - Р. 7-18.
- Ratledge C. Biodegradation of oils, fats and fatty acids. In: Biochemistry of microbial degradation. - Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1994. - 590 p.
- Пирог Т.П., Ивахнюк Н.А., Вороненко А.А. Микробный синтез экзополисахарида этаполана на различных видах отработанных растительных масел // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Cep. біял. навук. - 2017. - № 2. - С. 87-93.
- Подгорский В.С., Иутинская Г.А., Пирог Т.П. Интенсификация технологий микробного синтеза. - К.: Наук. думка, 2010. - 327 с.