Интерес исследователей к нетоксичным биодеградабельным микробным поверхностно-активным веществам (ПАВ) обусловлен широким спектром их возможного практического использования, в том числе в медицине [1]. Повышение резистентности микроорганизмов к антибиотикам и другим биоцидам способствовало поиску новых эффективных антимикробных средств [2, 3]. Несмотря на большое количество публикаций, касающихся антимикробной активности микробных ПАВ, применение этих продуктов микробного синтеза в медицине остается весьма ограниченным.
Ранее [4] нами показано, что штамм Acinetobacter calcoaceticus ИМВ В-7241 способен синтезировать ПАВ, обладающие антимикробной активностью.
В работе [5] установлена зависимость антимикробных свойств ПАВ A. calcoaceticus ИМВ В-7241 от условий культивирования продуцента. Это может быть обусловлено тем, что микробные ПАВ являются вторичными метаболитами и, как правило, синтезируются в виде комплекса подобных соединений [1], соотношение которых может изменяться в различных условиях культивирования продуцентов, что сопровождается изменением биологических свойств целевого продукта. По химической природе ПАВ A. calcoaceticus ИМВ В-7241 являются комплексом глико-, амино- и нейтральных липидов [6]. Согласно литературным данным [3] аминолипиды являются более эффективными антимикробными агентами, чем гликолипиды, а нейтральные характеризуются очень слабой антимикробной активностью. Однако на сегодняшний день влияние условий культивирования продуцента на биологические свойства ПАВ и возможность их регуляции остается вне внимания исследователей. Тем не менее, в работе [7] отмечается, что биосинтез аминолипидов с заранее заданными свойствами невозможен, а достичь этого можно только в результате постферментационной химической модификации синтезированных ПАВ.
По нашему мнению, выявление возможных активаторов и/или ингибиторов ключевых ферментов биосинтеза компонентов ПАВ с последующей соответствующей модификацией состава питательной среды позволит регулировать состав комплекса ПАВ, а следовательно, и свойства целевого продукта.
Ранее установлено [8], что ключевым ферментом биосинтеза аминолипидов у A. calcoaceticus IMB В-7241 являет-ся НАДФ+-зависимая глутаматдегидрогеназа.
Целью работы было исследовать влияние двухвалентных катионов Ca2+ и Mg2+ на активность НАДФ+-зависимой глутаматдегидрогеназы у А. calcoaceticus ИМВ В-7241 с последующей модификацией состава среды и определением антимикробной и антиадгезивной активности поверхностно-активных веществ.
Штамм ИМВ В-7241 выращивали в минеральной среде с этанолом в концентрации 1 % (по объему). В одном из вариантов в питательную среду вносили MgSO<7H2O в концентрации 0,2 г/л (количество в 2 раза больше, чем в базовой среде), в другом случае - СаСІ2 в концентрации 0,1 г/л.
Для получения бесклеточного экстракта культуральную жидкость после культивирования исследуемого штамма центрифугировали (4000 g, 15 мин, 4 °С) с подальшими манипуляциями. НАДФ+- зависимую глутаматдегидрогеназную активность экстракта анализировали по образованию глутамата при окислении НАДФН. Поверхностно-активные вещества экстрагировали из супернатанта культуральной жидкости смесью Фолча. Антимикробную активность определяли по показателю минимальной ингибирующей концентрации (МИК), антиадгезивную активность и степень разрушения биопленок тест-культур, ранее сформированных в ячейках иммунологического планшета, определяли спектрофотометрическим методом. В качестве тест-культур для определения биологических свойств исследуемых ПАВ использовали бактерии Escherichia coli ІЕМ-1, Bacillus subtilis БТ-2, Enterobacter cloaceae C-8, Staphylococcus aureus ВМС-1, Proteus vulgaris PA-12, взятых с коллекции микроорганизмов кафедры биотехнологии и микробиологии Национального университета пищевых технологий.
На первом этапе установили, что катионы кальция и магния являются активаторами НАДФ+- зависимой глутаматдегидрогеназы: при наличии 10 мМ Ca2+ и Mg2+ в реакционной смеси активность фермента повышалась в 1,5 раза по сравнению с таковой без катионов. Увеличение концентрации сульфата магния до 0,2 г/л или добавление CaCl2 (0,1 г/л) в среду культивирования А. calcoaceticus ИМВ В-7241 сопровождалось повышением активности НАДФ+-зависимой глутаматдегидрогеназы в 2,4 и 3,0 раза.
Исследование антимикробной активности поверхностно-активных веществ A.calcoaceticus ИМВ В-7241 показали, что минимальная ингибирующая концентрация ПАВ, синтезированных на модифицированных средах, по отношению к большинству тест-культур, была в 1,3-3,5 раза ниже по сравнению с МИК ПАВ, полученных на базовой среде: так, ингибирование роста E. coli ІЕМ-1 достигалось при концентрации ПАВ 16-24 и 28 мкг/мл соответственно.
Такую же закономерность наблюдали и на следующем этапе работы: адгезия микроорганизмов на абиотических поверхностях, обработанных поверхностно-активными веществами (1,25-5,0 мкг/мл), синтезированными в среде с повышенной концентрацией двухвалентных катионов, была в среднем на 517 % ниже по сравнению с показателями, установленными для ПАВ, образуемых на базовой среде: например, количество прикрепленных клеток B. subtilis БТ-2 составляло 14-26 и 23-48 % соответственно. Отметим, что и степень разрушения биопленки тест-культур была на 7-13 % выше при обработке ячеек планшета ПАВ (62-124 мкг/мл), синтезированными на модифицированных средах. При использовании таких ПАВ степень деструкции биопленки B. subtilis БТ-2 была максимальной и достигала 58 %.
Приведенные данные свидетельствуют о возможности регуляции антимикробной и антиадгезивной активности ПАВ штамма ИМВ В-7241 в процессе культивирования продуцента, что позволит получать препараты с необходимыми стабильными биологическими свойствами в зависимости от области их практического применения.
Список литературы
- Santos D.F., Rufino R.D., Luna J.M., Santos V.A., Sarubbo L.A. Biosurfactants: multifunctional biomolecules of the 21st century. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(3). doi: 10.3390/ijms17030401.
- Fair r.j., Tor Y. Antibiotics and bacterial resistance in the 21st century. Perspect. Med. Chem. 2014, 6(1), 25-64.
- Fracchia L., Banat j.j., Cavallo M., Ceresa C., Banat i.m. Potential therapeutic applications of microbial surface-active compounds. Bioengineering. 2015, 2(3), 144-162.
- Pirog T.P., Konon A.D., Skochko A.B. Microbial surface active substances use in biology and medicine. Biotekhnolohiia. 2011, 4(2), 24-38. (In Ukrainian).
- Pirog t.p., Savenko i.v., Shevchuk t.a., Krutous n.v., Iutynska g.o. Antimicrobial properties surfactants synthesized under different cultivation conditions of Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241. Microbiol. Zh. 2016, 78(3), 2-12. (In Ukrainian).
- Pirog T.P., Sofilkanych A.P., Konon A.D., Shevchuk T.A., Ivanov S^A. Intensification of surfactants’ synthesis by Rhodococcus erythropolis IMV Ac-5017, Acinetobacter calcoaceticus IMV В-7241 and Nocardia vaccinii K-8 on fried oil and glycerol containing medium. Food Bioprod. Proces. 2013, 91(2), 149-157.
- Mandal s.m., Barbosa a.e., Franco o.l. Lipopeptides in microbial infection control: scope and reality for industry. Biotechnol. Adv. 2013, 31(5), 338-345.
- Pirog T.P., Shevchuk T.A., Mashchenko O. Yu., Parfenyuk S.A., Iutinskaya G.A. Effect of growth factors and some microelements on biosurfactant synthesis of Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241. Microbiol. Zh. 2013, 75(5), 19-27. (In Russian).