Химико-токсикологическое исследование отравлений прегабалином с лоразепамом

Резюме

Анксиолитики являются наиболее широко применяемыми средствами коррекции тревожных состояний в медицинской практике. Прегабалин применяют как в монотерапии, так и в комбинациях с другими анксиолитиками, такими как лоразепам. Однако, наряду с положительным терапевтическим эффектом, эти препараты в определенных условиях (при передозировке, злоупотреблении, повышенной чувствительности организма) оказывают токсическое действие на организм человека. Отравления анксиолитиками занимают лидирующие позиции среди отравлений лекарственными препаратами. Отравления прегабалином и лоразепамом наиболее часто встречаются среди молодых людей 16 - 30 лет, которые принимают его для получения наркотического эффекта. Длительное применение прегабалина и лоразепама, вне зависимости от комбинирования их между собой, способно вызвать психологическую и физическую зависимости [1].

Ключевые слова: анксиолитики, прегабалин, лоразепам, тревожные расстройства

Цель исследования: Целью данной статьи является разработка способов изолирования и обнаружения прегабалина и лоразепама в моче пациентов при совместном присутствии.

Материалы и методы: Объектами исследования служили субстанция прегабалина «Sigma – Aldrich» (США) с чистотой 99,998% и таблетки «Лорафен» 2,5 мг от фирмы «Польфа Тархомин». Для создания рН образцов мочи использовали кислоту хлороводородную концентрированную (х.ч.) и 5 М калия гидроксид (28,054 г калия гидроксида (ч.д.а.) растворяли в 100 мл дистиллированной воды). Для контроля рН образцов мочи использовали универсальную индикаторную бумагу ПНД 50-975-84 (Чехия) и рН-метр «MettlerToledo» MP225 (Швейцария). В качестве экстрагентов при проведении пробоподготовки, а также при выборе подвижной фазы для метода ТСХ использовали следующие растворители: толуол (ч.д.а.), ацетон (х.ч), изопропанол (х.ч.), циклогексан (ч.), хлороформ (х.ч.), 25% раствор аммиака, этанол 95%, ацетонитрил. В качестве дериватизирующего реактива использовали MSTFA (Nметил-N-триметилсилил-трифторацетамид) фирмы «Sigma» (США) и готовили «mix» (смесь 10 мг иодида аммония, 5 мл MSTFA и 30 мклэтилмеркаптана). Дозирование проб, рабочих растворов и реактивов осуществляли однора-зовыми пластиковыми пипетками на 3 мл, либо дозаторами 23 пипеточными со сменными наконечниами на 5 – 100 мкл или на 100 – 1000 мкл[2].

Для подтверждения подлинности исследуемых образцов использовали инфракрасный спектрометр «Nicolet Avatar 330FT-IR» с типом детектора «DTGS». Методика: около 500 мг калия бромистого помещают в агатовую ступку. Тщательно измельчают. Затем к бромиду калия добавляют около 5 мг анализируемого образца, тщательно смешивают и растирают до исчезновения блеска кристаллов. Затем про помощи пресса формируют таблетку для снятия ИК-спектра.

Для УФ-спектрофотометрического метода готовили испытуемый раствор: навеску препарата (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, наливают 30 мл этилового спирта, растворяют, доводят объем раствора изопропиловым спиртом до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, перемешивают и доводят объем до метки этиловым спиртом (раствор Б). Измеряют оптическую плотность в интервале длин волн от 200 до 360 нм (для лоразепама) и от 300 до 600 нм (для прегабалина) в кювете толщиной пропускающего слоя 10 мм относительно чистого растворителя. В качестве раствора сравнения используют этиловый спирт. Методика приготовления образца: точную навеску исследуемого образца помещают в мерную колбу, наливают рассчитанный объем этилового спирта, тщательно перемешивают и доводят объем до метки тем же растворителем. (раствор А). Раствор А объем в объемах наливаем в мерную колбу на 50 мл и доводим до метки этиловым спиртом.

Результаты и обсуждение: Одним из вариантов пробоподготовки была предложена методика относительно быстрой пробоподготовки образцов мочи для последующего газохроматографического анализа. Для прегабалина брали образец мочи объемом 1 мл центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. Далее 100 мкл образца мочи перенесли в виалу, упаривали досуха в токе инертного газа (гелия) при комнатной температуре. После этого к сухому остатку добавляли дериватизирующий агент «mix» (смесь 10 мг иодида аммония, 5 мл MSTFA и 30 мклэтилмеркаптана) и выдерживали в термостате при температуре 80°С в течение 30 минут в герметично закрытой виале. После охлаждения добавили 50 мкл ацетонитрила, перенесли во вставку и анализировали. Для лоразепама была выбрана классическая жидкость-жидкостная экстракция из-за хорошей растворимости препарата в орагнических растворителях. 10 мл мочи подщелачивали NaOH до рН 10. Экстрагировали дважды хлороформом двойным объемом. Органический растворитель упаривали досуха в токе инертного газа (гелия) при комнатной температуре. Вследствие особенностей распределения и метаболизма производных 1,4-бензодиазепина, их определение целесообразно проводить по продуктам их гидролиза – аминобензофенонам. Это позволяет определять общее количество препаратов в биологической жидкости.

Изолирование. К 10 мл анализируемой мочи добавляли 10 мл концентрированной НСl и нагревали в колбе с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. По окончании реакции гидролизат нейтрализовали насыщенным раствором NaOH, доводили рН до 8-10 и экстрагировали дважды хлороформом (10 мл х 2). Слой органического растворителя отделяли на делительной воронке, а затем в объединенных экстрактах упаривали органический растворитель досуха в токе инертного 31 газа (гелия) при комнатной температуре. После этого к сухому остатку добавляли дериватизирующий агент «mix» и термостатировали при температуре 80°С в течение 30 минут в герметично закрытой виале. После охлаждения добавили 50 мкл ацетонитрила, перенесли во вставку и анализировали. Данная методика пробоподготовки позволяет с помощью ГХ-МС обнаружить прегабалин и лоразепам непосредственно в самой моче, однако, в данном случае не предусмотрено процесса очистки от мочевины и других фоновых компонентов мочи.

Химико – токсикологическое исследование проводилось с помощью предварительного метода тонкослойной хроматографии и подтверждающего метода газовой хроматографии в сочетании с масс – спектрометрией [3,4]. На основании физико – химических свойств лоразепама и прегабалина из литературных источников были выбраны хроматографические параметры разделения и обнаружения токсикантов. В качестве подвижной фазы были исследованы четыре системы растворителей: S1. Толуол- ацетон-этанол- аммиак (45:45:7:3) S2. Изопропанол-ацетон-аммиак-вода (22:25:4:7) S3. Циклогексан-толуол-ацетон (74:15:10) S4. Хлороформ-ацетон (40:20)

Хроматографирование проводили на пластинках Sorbfill ПТСХ-АФ-В- УФ и Sorbfill ПТСХ- ПА(неподвижная фаза).

Таблица 1- Результаты хроматографирования прегабалина и лоразепама

Представленные данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что в найденных оптимальных условиях хроматографирования в используемых четырех системах растворителей значения Rf у

лоразепама находится в интервале 0,1–0,79, а у прегабалина – 0,51-0,64 Это позволяет использовать разработанные методики для обнаружения препаратов после изолирования из биологических объектов при проведении химико-токсикологического анализа.

Был изучен метод инфракрасной спектроскопии в средней области, так как в ближней ИК- области (10000-4000 см-1, или 1-2,5 мкм), где расположены обертоны и составные частоты основных колебаний молекул полосы поглощения имеют интенсивность в 102-103 раз меньше, чем в средней ИК-области (4000-200 см-1) [5 6].

Согласно результатам исследования, большое количество характерных полос поглощения при использовании метода инфракрасной спектроскопии в средней области в анализе образцов позволяет дифференцировать их между собой, а также в общем анализе лекарственных средств.

При проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований эксперты обязаны использовать подтверждающие инструментальные методы согласно Приказу Минздравсоцразвития РФ № 346н от 12.05.2010 г. «Об утверждении Порядка организации и

производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации», к которым относится спектрофотометрия в УФ-области [7]. Измерение спектральных характеристик в УФ-области поглощения лоразепама в интервале 200-360 нм при концентрации 10 мкг/мл с интервалом сканирования 1 нм в кювете с толщиной слоя 1 см показало, что характерные спектры для лоразепама наблюдались от 232 нм, для прегабалина в интервале поглощения 300-600 нм наблюдались характерные спектры от 402нм.

На рисунке №5 представлена типичная ГХ-хроматограмма и масс-спектры лоразепама и прегабалина, на рисунке №6 и №7 соответственно. Приведенные хроматограммы демонстрируют высокую степень разделения, а также точность проводимого исследования.

Выводы. Найдены оптимальные системы растворителей для хроматографирования, позволяющие разделить изучаемые вещества от эндогенных соединений в извлечениях, переходящих из биологического объекта. Выбрана методика идентификации прегабалина и лоразепамама по характерным полосам поглощения при использовании метода инфракрасной спектроскопии в средней области. Были изучены спектральные характеристики препаратов при использовании метода УФ-

70

спектроскопии. Это позволило использовать данный метод для идентификации изучаемых соединений.

Литература

1. Сторожаков Я.А. Применение прегабалина при генерализированном тревожном расстройстве// Социальная и клиническая психиатрия, 2014. №1.С.57.
2. Wittchen H.U. Generalized anxiety disorder: prevalence, burden, and cost to society. Depress Anxiety 2002; 16: Suppl 4: 162-171.
3. Кристиан Г. Аналитическая химия: в 2 томах. Пер. с англ.- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.
4. ХаритоновЮ.Я. Аналитическая химия в 2-х томах. – М.: «Высшая школа» 2003.
5. British Pharmacopoeia (2007)
6. Luciana Petrone, Mariela Baldut, Silvina L. Bonafede, Laura D. Simionato, Adriana I. Development and Validation of a NonAqueous Titrimetric Assay for the Determination of Pregabalin in Bulk Drug //Pharmaceutical Chemist Review.Volume 1. 2015.
7. Приказ МЗ №346н от 12.05.2010 г. « Об утверждении порядка организации и производства судебно – медицинских экспертиз в государственных судебно – экспертных учреждениях РФ»