Цитопротективное действие некоторых полифенольных растительных экстрактов

Аннотация

Известно, что природные антиоксиданты широко распространены в пищевых продуктах и лекарственных растений, в том числе и дикорастущих ягодах, которые выделяют особо, как источник субстанций с антирадикальной активностью. В настоящей работе ставилась задача исследовать на первичном уровне invitro выраженность цитопротекторного эффекта наиболее распространённых и доступных вариантов полифеноль-ных экстрактов. Авторами представлены результаты исследования уровня концентрации полифенолов в растительных экстрактах северных ягод черники, голубики виноградасорта Каберне Совиньон, верблюжьей колючки

Ключевые слова: цитопротекторы, медицина антистарения, свободные радикалы, природные антиоксиданты, полифенольные экстракты.

Медицина антистарения или antiaging медицина - это одно из самых динамично развивающихся направлений в современной науке [1,2]. Нет сомнений в том, что это направление в ближайшие годы станет одной из ведущих наук. Известно, что в стареющем организмепостепенно нарастает концентрация активных форм кислорода и активных форм азота, таких как супероксид, гидроксил, окись азота и радикалы, которые могут повреждать ДНК и приводить к окислению липидов и белков в клетках [3]. На свободнорадикальной теории старения основан поис кантиоксидантов в качестве геропротекторов [4,5]. Согласно этой теории, свободные радикалы эндогенной и экзогенной природы оказывают множественные повреждающие эффекты на макромолекулы (нуклеиновые кислоты и белки), вызываяих деградацию и старение [6-9].

К настоящему времени создана база данных Geroprotectors.org предоставляющая исследователям, заинтересованным в замедляющих старение соединениях, универсальный ресурс, позволяющий сэкономить огромное количество времени на поиски данных, изучение литературы и экспертный анализ. База данных содержит резюме для более чем 250 экспериментов, в которых изучалось более 200 геропро- тективных соединений, и преобладающая масса из них является антиоксидантами [10].

Природные антиоксиданты, особенно полифенолы, обладают широким спектром биологического действия, проявляют, в том числе и геропротекторный эффект, состоящий из цитопротекторных, антивос- палительных, антимутагенных, антиатеросклеротических и противоопухолевых компонентов [11]. Цито- протекторный механизм действия полифенолов, в силу своей универсальности, привлекает особое внимание исследователей [12], например, именно этот интегративный эффект интенсивно изучается у отдельных полифенолови их концентратов из различных растений [13-16]. Потенциальные терапевтические эффекты полифенольных экстрактовк настоящему времени описаны в минимальной степени.

Цель: В связи с чем, в настоящей работе ставилась задача исследовать на первичном уровне invitro выраженность цитопротекторного эффекта наиболее распространённых и доступныхвариантов полифенольных экстрактов.

Материалы и методы. Полифенольные экстракты северных ягод черники и голубики были получены в Сургутскомуниверситете Ханты-Мансийского округа Тюменской области Российской Федерации, полифенольный концентрат винограда Каберне Совиньон был получен в НИИ пищевой и перерабатывающей промышленности (Казахстан, Алматы), экстрактверблюжьей колючки киргизской (AlhagiKirgisorumScrenk) был получен в Казахском Национальном медицинском университете имени С. Д.

Асфендиярова(Казахстан, Алматы), все экстракты были любезно предоставлены нам партнерамидля исследования.

Концентрацию полифенолов в образцах исследовали, используя коммерческий набор для определения концентрации полифенолов «Polyphenolsfolin-ciocalteu (ENOLOGY linebyBioSytems.Spain)», в соответствии с инструкцией производителя реагента по методу Singleton [17]. Принцип этого метода основан на способ-ность полифенолов в составе экстрактов вступать в реакцию реагентом Фолина- Чокольтеу (Folin-Ciocalteu) в щелочной среде. В результате с усиление окраски пропорционально увеличению концентрации полифенолов. Концентрации выражены в мг/л эквивалента галловой кислоты (gallicacid) на основе стандартной кривой созданной по галловой кислоте. Работа с клеточными культурами была проведена в лаборатории Центра наук о жизни Назарбаев Университета. После исследования концентрации полифенолов для дальнейшей работы экстракты стандартизовали, доводя концентрацию до 10 мг/мл.

МТТ-тест. Первичная культура альвеолярных макрофагов кролика. Для получения альвеолярных макрофагов использовали здорового кролика шиншилла весом 3,2 кг. Кролик находился в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Кролика наркотизировали с помощью тиопентала натрия, введенного в краевую ушную вену из расчета 40 мг/кг. Вскрывали грудную полость, передний конец трахеи выделяли из окружающих тканей, зажимали таким образом, чтобы в неё не поступала кровь, перерезали впереди зажима. Задний отдел трахеи с зажимом, лёгкие и сердце извлекали целиком. Осторожно удаляли сердце, следя за тем, чтобы не повредить легкие и бронхи. Далее полученный препарат отмывали от крови тёплым физиологическим раствором (37 °С), осторожно промокая марлевым тампоном. С трахеи снимали зажим и заливали в нее тёплый раствор Хэнкса (37 °С) до тех пор, пока лёгкие не расправятся (около 40-50 мл раствора Хэнкса). Заливали непосредственно в главные бронхи, сначала в один, потом в другой, при этом происходило равномерное растяжение всех долей лёгкого. Затем трахею снова пережимали, лёгкие осторожно массировали, снимали зажим и жидкость выливали в охлаждённую стерильную центрифужную пробирку объёмом 50 мл. Эту процедуру проводили дважды. Оба смыва центрифугировали 20 минут при 1000 об/мин на холоде (4°С). Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в заранее подготовленной полной питательной среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мM L-глутамина, 1% гентамицина в качестве антибиотика. Далее подсчитывали количество клеток в камере Горяева, используя краситель трипановый синий, для которого живые клетки непроницаемы, а мертвые окрашиваются в синий цвет. Проводили подсчёт только живых клеток. После подсчёта клеток суспензию разводили культуральной средой таким образом, чтобы в конечном разведении число клеток в суспензии оказалось 1х10⁶/мл, после чего клеточную суспензию переносили в 24-луночные планшеты для культивирования по 1,0 мл в каждую лунку и инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут. После прикрепления макрофагов ко дну планшета исходную среду меняли на свежую тёплую среду (37°С), удаляя из культуры не прикрепившиеся посторонние клетки.В лунки вносили исследуемые соединения (0,1 мл): экстракты клюквы, черники и брусники в разведениях 1:10 и 1:100; доксорубицин в конечной концентрации 1 мкг/мл и 10 мкг/мл;доксорубицин 10 мкг/мл + экстракты клюквы, брусники, черники (разведение 1:100); контроль – клетки без добавления исследуемых субстанций (0,1 питательной среды). Инкубировали при 37°C в атмосфере CO2 (5 %)в течение 2 часов. Жизнеспособность клеток в контроле (клетки без добавления экстрактов) принимали за 100 %. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трёх повторностях.

МТТ-тест проводили в соответствии с СОПом, основанном на инструкции производителя “Invitro toxicologyAssaykit MTT based” (Sigma). Принцип МТТ-теста основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразола (МТТ- реаген-та) до голубого кристаллического формазана, растворимого в диметилсульфоксиде.Коэффициент поглощения цветного раствора выражали количественно путём измерения при длине волны 550нм методом спектрофотометрии (Evolution 201 ThermoScientific).

Жизнеспособность клеток в контроле (клетки без добавления исследуемых субстанций) принимали за 100%. Припроведении настоящего исследования учитывали должные принципы обращения с экспериментальными животными, изложенные в European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimentation and other Scientific Purposes, N 123 of 18 March 1986 и Protocol of Amendment to the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, Strasbourg, 22 June 1998 [19]. На выполнение данной работы было получено разрешение локального Биоэтического комитета Центра наук о жизни Назарбаев Университета.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ «Statistica 6,0». Полученные результаты представлены в виде «среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения» [20].

Результаты и обсуждение. Результаты исследования уровня концентрации полифенолов в растительных экстрактах представлены в таблице 1.

Как видно из полученных данных максимальная концентрация полифенолов присуща концентрату винограда, однако практически такая же концентрация представлена в экстрактах северных ягод черники и голубики. Эти данные, полученные в условиях нашего эксперимента, подтверждают ранее известные факты относительно экстрактов винограда[18].Результаты определения содержания полифенолов дополняют данные, К.Д. Рахимова и соавторов[19], впервые обнаружившими высокое содержание антоцианов в алхидине.

Результаты исследования изменения жизнеспособности изолированных клеток в условиях invitro под влиянием экстрактов клюквы, черники, винограда и алхидина в МТТ-тесте на альвеолярных макрофагах кролика представлены в таблице 2.

В таблице представлены показатели жизнеспособности клеток в % относительно взятой за 100% жизнеспособности альвеолярных макрофагов кролика в контроле (клетки без добавления экстрактов). Как видно, при добавлении к альвеолярным макрофагам экстрактов северных ягод в разведении 1:100 жизнеспособность клеток в сравнении с контролем не менялась, цитотоксическое действие отсутствовало, при внесении более концентрированного образца экстракта жизнеспособность клеток несколько увеличивалась. Отрицательный контроль, в качестве такового использовали доксорубицин, продемонстри-ровал очевидное дозозависимое снижение жизнеспособности клеток. Однако, присутствие в питательной среде экстрактов северных ягод до определённой степени нивелирует цитотоксическое действие доксорубицина.

Как видно, при инкубации течение 2 часов или 48 часов клеток с растительными экстрактами выявле-на способность предупреждать снижение жизнеспособности в присутствии цитотоксического агента. Считаем, что эти результаты дают нам основания для предположения о наличии цитопротекторного потенциала у иссле-дованных растительных экстрактов.

Предполагаем, что входящие в состав экстрактовчерники, брусники, винограда и алхидина- полифе-нольные (в основном флавоноиды, антоцианы и проантоцианидины), как антиоксиданты, способны защищать клетки от оксидативного повреждения, присутствующего в механизме цитотоксич-ности доксорубицина. Известно, что токсикологический профиль антрациклиновых антибиотиков (куда относится и доксорубицин) invivo в целом повторяет клинический профиль данных препаратов[20], а invitro в

82

отношении неопухолевых клеток именно стимуляция взрыва свободных радикалов кислорода и азота (оксидативный стресс), является пусковым звеном цитотоксичности[20,21].

Полифенолы ягод черники и голубики имеют существенный антиоксидативный потенциал, что показано в ряде исследований [23-25], полифенолы винограда и алхидина также, судя по предшествующим публикациям проявляют антиоксидативное действие [26].

Предполагаем, что антирадикальный, антиоксидантный эффект полифенолов, содержащихся в исследуемых растительных экстрактах вероятно является механизмом цитопротекторного действия. Мы вполне согласны с мнением K.S.Bhullar и H.P.Rupasinghe[27] в отношении того, что природные антиоксиданты – полифенолы ягод, фруктов и ряда других растений, способны проявлять цитопротективное действие. Пока мы не имеем существенных доказательств возможности проявления цитопротективного эффекта полифенольных экстрактов invivo, но результаты работ по гепатопротекторному действию [28-30] и кардиопротекторному действию [31,32] полифенолов из винограда позволяют надеяться на широкое распространение феномена цитопротекторного действия среди концентратов полифенолов сходных по составу из других растений. Отдельные публикации усиливают это впечатление, так показано защитное действие invitroполифенольных экстрактов клюквы и черники в отношении клеток Caco-2, имитирующих клетки кишечника, проявляющееся в снижении уровня свободных радикалов в гомогенате клеток после инкубации [33]. Установлено также, что макрофаго-подобные клетки культуры U937 и эпителиальные клетки меньше страдали от оксидативного стресса, вызванного внесение в культуру субстанции бактериальноголипополисахарида [34].

Таким образом, полагаем, что есть основания считать цитопротекторный эффект invitro, может быть частью механизма действия полифенольных экстрактов многих растений и это свойство может положено в основы разработки прототипов лекарственных препаратов в последующем.

Литература

1. Vaiserman AM, Lushchak OV, Koliada AK. Anti-aging pharmacology: Promises and pitfalls.Ageing Res Rev. 2016 Nov;31:9-35
2. Childs BG, Durik M, Baker DJ, van Deursen JM. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nat Med. 2015 Dec;21(12):1424-35.
3. Peng, C.; Wang, X.; Chen, J.; Jiao, R.; Wang, L.; Li, Y.M.; Zuo, Y.; Liu, Y.; Lei, L.; Ma, K.Y.; et al. Biology of ageing and role of dietary antioxidants. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 831841
4. Manayi A, Saeidnia S, Gohari AR, Abdollahi M. Methods for the discovery of new anti-aging products--targeted approaches.ExpertOpin Drug Discov. 2014 Apr;9(4):383-405
5. Zhang YJ, Gan RY, Li S, Zhou Y, Li AN, Xu DP, Li HB. Antioxidant Phytochemicals for the Prevention and Treatment of Chronic Diseases. Molecules. 2015 Nov 27;20(12):21138-56.
6. Han C, SomeyaS.Maintaining good hearing: calorie restriction, Sirt3, and glutathione. ExpGerontol. 2013 Oct;48(10):1091-5.
7. Obrenovich ME, Li Y, Parvathaneni K, Yendluri BB, Palacios HH, Leszek J, AlievG.Antioxidants in health, disease and aging. CNS NeurolDisord Drug Targets. 2011 Mar;10(2):192-207
8. Ergin V, Hariry RE, Karasu C. Carbonyl stress in aging process: role of vitamins and phytochemicals as redox regulators. Aging Dis. 2013 Oct 1;4(5):276-94.
9. Bastianetto S, Ménard C, Quirion R. Neuroprotective action of resveratrol. BiochimBiophysActa. 2014 Oct 2. pii: S0925-4439(14)00292-0.
10. Geroprotectors.org: a new, structured and curated database of current therapeutic interventions in aging and age- related disease/Alexey Moskalev, ElizavetaChernyagina, João Pedro de Magalhães, et al./AGING 2015,Vol7,No9, pp 616-628
11. Xu DP, Li Y, Meng X, Zhou T, Zhou Y, Zheng J, Zhang JJ, Li HB. Natural Antioxidants in Foods and Medicinal Plants: Extraction, Assessment and Resources. Int J Mol Sci. 2017 Jan 5;18(1). pii: E96. doi: 10.3390/ijms18010096
12. Kabir F, Tow WW, Hamauzu Y, Katayama S, Tanaka S, Nakamura S Antioxidant and cytoprotective activities of extracts prepared from fruit and vegetable wastes and by-products. Food Chem. 2015 Jan 15;167:358-62
13. Kalaiselvi P, Rajashree K, BharathiPriya L, Padma VV. Cytoprotective effect of epigallocatechin-3-gallate against deoxynivalenol-induced toxicity through anti-oxidative and anti-inflammatory mechanisms in HT-29 cells. Food ChemToxicol. 2013 Jun;56:110-8.
14. Lombardi G, Prosperini A, Font G, Ruiz MJ. Effect of polyphenols on enniatins-induced cytotoxic effects in mammalian cells. ToxicolMech Methods. 2012 Nov;22(9):687-95.
15. Svobodová A, Rambousková J, Walterová D, Vostalová J. Bilberry extract reduces UVA-induced oxidative stress in HaCaT keratinocytes: a pilot study. Biofactors. 2008;33(4):249-66.
16. La VD, Labrecque J, Grenier D. Cytoprotective effect of proanthocyanidin-rich cranberry fraction against bacterial cell wall-mediated toxicity in macrophages and epithelial cells. Phytother Res. 2009 Oct;23(10):1449-52.
17. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventós RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 1999; 299:152–178
18. Gulyayev A., Shulgau Z., Tritek V., Nurgozhin T. Composition and potential biological effects of polyphenol concentrate from Kazakhstan Cabernet Sauvignon collection of grapes // 8th World Congress on Polyphenols Applications. – Lisbon, 2014. – P. 256.
19. Биологически активный комплекс–алхидин и его фармакологическая активность / ГШ Бурашева, ЖА Абилов, КД Рахимов Алматы.-2001.-180 с
20. Soby SD, Gadagkar SR, Contreras C, Caruso FL. Chromobacteriumvaccinii sp. nov., isolated from native and cultivated cranberry (VacciniummacrocarponAit.) bogs and irrigation ponds. Int J SystEvolMicrobiol. 2013 May;63(Pt 5):1840-6.
21. http://worldanimal.net/council.html
22. Лакин, Г.Ф. Биометрия – М: Высш. школа, 1980. – 293 с.
23. Szwed M, Wrona D, Kania KD, Koceva-Chyla A, Marczak A. Doxorubicin-transferrin conjugate triggers prooxidative disorders in solid tumor cells.Toxicol In Vitro. 2016 Mar;31:60-71.
24. Wei L, Surma M, Gough G, Shi S, Lambert-Cheatham N, Chang J, Shi J. Dissecting the Mechanisms of Doxorubicin and Oxidative Stress-Induced Cytotoxicity: The Involvement of Actin Cytoskeleton and ROCK1. PLoS One. 2015 Jul 2;10(7):e0131763. doi: 10.1371/journal.pone.0131763.
25. Mai Y, Yu JJ, Bartholdy B, Xu-Monette ZY, Knapp EE, Yuan F, Chen H, Ding BB, Yao Z, Das B, Zou Y, Young KH, Parekh S, Ye BH. An oxidative stress-based mechanism of doxorubicin cytotoxicity suggests new therapeutic strategies in ABC-DLBCL.Blood. 2016 Dec 15;128(24):2797-2807.
26. Medicinal plants of Kazakhstan and their use MK Kukenov, SM Adekenov, KD Rakhimov, AI Isambaev, BN SauranbaevGalym, Alma-Ata, 217
27. Namiesnik J., Vearasilp K., Nemirovski A., Leontowicz H., Leontowicz M. In vitro studies on the relationship between the antioxidant activities of some berry extracts and their binding properties to serum albumin // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2014.- Vol.72, №6. Р.2849-2865.
28. McKay D.L., Chen C.Y., Zampariello C.A., Blumberg J.B. Flavonoids and phenolic acids from cranberry juice are bioavailable and bioactive in healthy older adults // Food Chem. – 2015.- Vol. 168.-P. 233-240.
29. Bhullar K.S., Rupasinghe H.P. Antioxidant and cytoprotective properties of partridgeberry polyphenols. // Food Chem. – 2015.- Vol.168.- P.595-605
30. Bhullar K.S., Rupasinghe H.P. Antioxidant and cytoprotective properties of partridgeberry polyphenols // Food Chem. – 2015. – Vol. 168, №1. –P.:595-605.
31. Singh D, Baghel US, Gautam A, Baghel DS, Yadav D, Malik J, Yadav R. The genus Anogeissus: A review on ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology. J Ethnopharmacol. 2016 Dec 24;194:30-56
32. Nassiri-Asl M, Hosseinzadeh H. Review of the Pharmacological Effects of Vitisvinifera (Grape) and its Bioactive Constituents: An Update. Phytother Res. 2016 Sep;30(9):1392-403
33. Wang Z, Zhang Z, Du N, Wang K, Li L. Hepatoprotective Effects of Grape Seed Procyanidin B2 in Rats With Carbon Tetrachloride-induced Hepatic Fibrosis. AlternTher Health Med. 2015;21Suppl 2:12-21.
34. Leifert WR, Abeywardena MY. Cardioprotective actions of grape polyphenols. Nutr Res. 2008 Nov;28(11):729-37
35. Wightman JD, Heuberger RA. Effect of grape and other berries on cardiovascular health. J Sci Food Agric. 2015 Jun;95(8):1584-97.
36. Slemmer JE, Livingston-Thomas JM, Gottschall-Pass KT, Sweeney MI. Cranberries and wild blueberries treated with gastrointestinal enzymes positively modify glutathione mechanisms in Caco-2 cells in vitro. J Food Sci. 2013 Jun;78(6):H943-7
37. La VD, Labrecque J, Grenier D. Cytoprotective effect of proanthocyanidin-rich cranberry fraction against bacterial cell wall-mediated toxicity in macrophages and epithelial cells. Phytother Res. 2009 Oct;23(10):1449-52