Определение антимикробной активности экстрактов из травы Melissa officinalis L.

Постоянный рост антибиотикоустойчивости бактерий создает необходимость для разработки антимикробных препаратов из экстрактов лекарственных растений. В статье впервые представлены результаты антимикробной активности экстрактов Melissa officinallis L. (мелисса лекарственная), полученных различными методами, в том числе и ультразвуковой экстракцией. Изучение антимикробной активности образцов проводилось по отношению к штаммам грамположительных бактерий Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, к грамотрицательным штаммам Escherichia coli и к дрожжевому грибку Candida albicans. Выявлено, что образцы водных экстрактов мелиссы лекарственной, полученные при настаивании и при экстракции ультразвуком, обладают выраженным антимикробным действием в отношении Staphylococusaureus, ультразвуковые экстракты 30- и 90 %-спиртовые экстракты и водный экстракт активны в отношении Staphylococus aureus и Bacillus subtilis и все образцы проявили слабую активность к грамотрицательной палочковидной бактерии Escherichia coli. Полученные данные могут быть использованы для разработки новых фитопрепаратов с выраженной антимикробной активностью.

Введение

Во флоре Казахстана произрастает более 1000 эфиромасличных растений [1]. Большой интерес представляют некоторые виды из семейств Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae, которые раньше не изучались, или по которым имеются только краткие сведения о химическом составе и биологических свойствах. В этом отношении интерес представляет семейство Lamiaceae Lindl., являющееся одним из крупнейших во флоре Казахстана. Так, на территории республики в данном семействе насчитывается 233 вида, объединенных в 45 родов [2]. Растения данного семейства, богатые эфирными маслами и полифенольными соединениями, в течение многих столетий используются для лечения бактериальных заболеваний [3–10].

Род мелисса (Melissa L.) относится к семейству Lamiaceae; наиболее ценным видом является мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.). В Республике Казахстан вид не произрастает, но культивируется в предгорьях Заилийского и Джунгарского Алатау [2]. Ввиду широкого применения ее в медицине, парфюмерно-косметической и пищевой промышленности, мелиссу лекарственную также культивируют во многих странах мира. Melissa officinalis является фармакопейным растением в Республике Казахстан [11], официально применяется в качестве лекарственного средства. Основными видами фармакологической активности травы мелиссы лекарственной считаются седативная, противовирусная, антиоксидантная, антибактериальная, противовоспалительная [12].

Ранее были изучены антимикробные свойства эфирного масла и различных экстрактов из Melissa officinalis. Эфирное масло обладало выраженной антимикробной активностью против пяти патогенных бактерий человека, одного дрожжевого Candida albicans и двух фитопатогенных грибов [13]. Выявлена эффективная антибактериальная активность против мультирезистентного штамма Shigella sonei [14, 15], а также выраженная антимикробная активность этанольного экстракта Melissa officinalis [16].

В настоящее время возрастает потребность в мелиссе лекарственной из-за ее биологической ценности. Исходя из сказанного выше, цель настоящей работы — оценка антимикробной активности экстрактов из травы мелиссы лекарственной, полученной разными методами.

Объекты и методы исследований

Для экстрагирования воздушно-сухого сырья Melissa officinalis применяют воду, этиловый спирт различной концентрации (30, 50, 70 и 96 %). Измельченную (3–5 мм) траву мелиссы лекарственной (20,0 г) экстрагировали двадцатикратным количеством воды или этилового спирта методом настаивания. Для полного истощения сырья экстракцию проводили в три этапа, из которых первое и второе настаивания производили при комнатной температуре в течение двух суток, третья экстракция была термической — 1 ч при 90 ºС с обратным холодильником. Полученные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом при температуре не выше 60 ºС [17].

Нами впервые для извлечения суммы экстрактивных веществ из травы мелиссы лекарственной применена ультразвуковая экстракция. 20,0 г травы мелиссы лекарственной помещали в емкость для экстрагирования и заливали экстрагентом — водой, смесью этиловый спирт–вода, в соотношении 1:20 об./об. Ультразвуковую экстракцию сырья проводили без замачивания на установке Ultrasonic Сleaner Sonic-3 при частоте ультразвукового излучения 40 кГц, при комнатной температуре (20– 22 ºС), в течение 30 мин. Затем жидкий экстракт сливали и экстракцию повторяли еще 1 раз при тех же условиях. Экстракцию также проводили 30, 50, 70 и 90-процентным этиловым спиртом.

Полученные объединенные жидкие экстракты мелиссы лекарственной фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат жидкий экстракт мелиссы лекарственной заливали в роторный испаритель и проводили упаривание экстрагента при температуре 50 ºС, получили густой экстракт мелиссы лекарственной. Остаточный растворитель из густого экстракта выпаривали на водяной бане при температуре 60 ºС. Получены сухие ультразвуковые экстракты мелиссы лекарственной, которые представляют собой густую массу темно-зеленого цвета со специфическим запахом.

Скрининг образцов на антимикробную активность проведен на штаммах грамположительных бактерий Staphylococus aureus АТСС 6538, Bacillus subtilis 19659™ и грамотрицательного штамма Escherichia coli АТСС 8739 и к дрожжевому грибку Candida albicans 10231™ дискодиффузионным методом [18]. В качестве препаратов сравнения, согласно требованиям ГФ РК, использовали стандартные — бензилпенициллин для бактерий и нистатин для дрожжевого грибка C. albicans. Жидкой питательной средой согласно ГФ РК являлся питательный агар [19].

Для проведения исследования готовили взвесь, содержащую стандартное количество жизнеспособных клеток бактерий, которую засевали газоном на поверхность питательной среды в чашки Петри. На стерильные диски из фильтровальной бумаги наносили 0,01 мл образца. Диски с препаратами накладывали на посев на расстоянии 2,5 см от центра чашки по кругу (на одну чашку 4 диска). Посевы инкубировали 24 ч при 36 ºС. После инкубации, на фоне равномерного бактериального газона вокруг дисков образовывались зоны полного и частичного подавления роста бактерий. Учет результатов осуществляли путем измерения диаметра зон подавления роста.

Антимикробная активность образцов оценивалась по диаметру зон задержки роста тест-штам- мов (мм). Диаметр зон задержки роста меньше 10 мм и сплошной рост в чашке оценивали как отсутствие антибактериальной активности, 10–15 мм — слабая активность, 15–20 мм — умеренно выраженная активность, свыше 20 мм — выраженная. Каждый образец испытывался в трех параллельных опытах [20, 21].

Результаты и их обсуждение

В таблице представлены результаты исследования антимикробной активности водных и водно- этанольных экстрактов, полученных из воздушно-сухого сырья Melissa officinalis методом настаивания и с применением ультразвукового воздействия.

Из приведенных в таблице данных следует, что образцы водных экстрактов мелиссы лекарственной, полученные при настаивании и при экстракции ультразвуком, обладают выраженным антимикробным действием в отношении Staphylococus aureus, ультразвуковые экстракты 30 и 90 % спиртовые экстракты, а также водный экстракт активны в отношении Staphylococus aureus и Bacillus subtilis. Все образцы проявили слабую активность к грамотрицательной палочковидной бактерии — кишечной палочке Escherichia coli. Кроме того, была выявлена слабая антимикробная активность всех образцов в отношении Candida albicans.

Таблица Антимикробная активность исследуемых образцов экстрактов, мм

Примечание. * — экстракт, полученный в результате ультразвукового воздействия.

Стоит отметить повышение антимикробной активности вариантов экстрактов, которые были получены методом ультразвукового воздействия. Так, в варианте применения 30 %-ного спиртового экстракта зона подавления для Staphylococus aureus составила 25,0 мм, тогда как в варианте использования экстракта методом настаивания данный показатель составил 19,8 мм. В варианте испытания 70 %-ного водно-спиртового экстракта, полученного при помощи ультразвукового воздействия, зона подавления составила 20,0 мм, тогда как при методе настаивания — 18,7 мм. В варианте 90 %-ного экстракта — 23,5 и 19,2 мм соответственно. Исключение составили варианты опыта с водным экстрактом и 50 %-ным водно-спиртовым экстрактом, при которых большую активность показали варианты, полученные методом настаивания. Причем 50 %-ный водно-спиртовый экстракт обладает более выраженной антимикробной активностью по сравнению со стандартным препаратом бензилпенициллином.

В отношении Bacillus subtilis ультразвуковые экстракты оказались эффективнее тех, что были получены методом настаивания, в вариантах испытания водного экстракта (20,8 против 18,2 мм), 70 %-ного водно-спиртового (19,0 против 17,2 мм) и 90 %-ного водно-спиртового (23,2 против 17,0 мм). Для 30 %-ного водно-спиртового экстракта зона подавления оказалась аналогичной, для 50 %-ного водно-спиртового — была ниже (9,0 против 20,2 мм). Однако ни один вариант экстракта не превышает активность стандартного препарата бензилпенициллина в отношении данного микроорганизма.

Испытание в отношении Escherichia coli показало, что водный и все варианты водно-спиртовых экстрактов превышают по антимикробной активности стандартный препарат бензилпенициллин. Максимальные зоны подавления наблюдались в варианте с 30- и 70 %-ным водно-спиртовым экстрактами, полученными методом настаивания.

В отношении Candida albicans испытания антимикробной активности полученных экстрактов не показали превышения показателей стандартного препарата нистатина.

Заключение

Использование такого инновационного метода получения биологически активных веществ из мелиссы лекарственной, как ультразвуковая экстракция, является наиболее быстрым по времени, со сравнительно высоким выходом экстрактивных веществ, обладающих выраженной антимикробной активностью, а именно выявлено, что применение ультразвукового воздействия на траву мелиссы лекарственной повышает ее антимикробную активность в отношении грамположительных микробов.

Было установлено, что 30 %-ный водно-спиртовый экстракт мелиссы лекарственной, полученный методом ультразвуковой экстракции, превышал по антимикробной активности стандартный препарат бензилпенициллин.

Список литературы

1. Егеубаева Р . А. Дикорастущие эфирномасличные растения юго- востока Казахстана / Р.А. Егеубаева. — Алматы, 2002. — 241 с.
2. Флора Казахстана. — Т. 7. — Алма-Ата: Наука, 1964. — 497 с.
3. Андреева И.С. Сравнительная оценка антимикробной активности некоторых перспективных лекарственных растений / И.С. Андреева, И.Е. Лобанова, Г.И. Высочина, Н.А. Соловьянова // Растительный мир Азиатской России. — 2018. — № 1(29). — С. 91–99.
4. Логвиненко Л.А. Ароматические растения семейства Lamiaceae для фитотерапии / Л.А. Логвиненко, Л.А. Хлыпенко, Н.В. Марко // Фармация и фармакология. — 2016. — Т. 4, № 4. — С. 35–47.
5. Паштецкий В.С. Использование эфирных масел в медицине, ароматерапии, ветеринарии и растениеводстве (обзор) / В.С. Паштецкий, Н.В. Невкрытая // Тавр. вестн. аграр. науки. — 2013. — № 1(13). — С. 16–38.
6. Roldán L.P. Composition and antibacterial activity of essential oils obtained from plants of the Lamiaceae family against pathogenic and beneficial bacteria / L.P. Roldán, G.J. Díaz, J.M. Duringer // Rev Colomb Cienc Pecu. — 2010. — Vol. 23. — P. 451–461.
7. Carović-Stanko K. Medicinal Plants of the Family Lamiaceae as Functional Foods — a Review / K. Carović-Stanko, M. Petek, M. Grdiša, J. Pintar, D. Bedeković, M.H. Ćustić, Z. Satovic // Czech J. Food Sci. — 2016. — Vol. 34, Iss. 5. — Р. 377– 390.
8. Araújo S. Volatile compounds of Lamiaceae exhibit a synergistic antibacterial activity with streptomycin / S. Araújo, L. Alves, M. Pinto, G. Oliveira, E. Siqueira, R. Ribeiro, J. Ferreira, L. Lima // Brazilian Journal of Microbiology. — 2014. — Vol. 45, Issue 4. — P. 1341–1347.
9. Assis F. Antibacterial activity of Lamiaceae plant extracts in clinical isolates of multidrug-resistant bacteria / F. Assis, F. Siqueira, I. Goncalves, R. Lacerda, R. Nascimento, S. Araujo, J Andrade, K. Herrera, L. Lima, J. Ferreira // Anais da Academia Brasileira de Ciências. — 2018. — Vol. 90, Iss. 2. — P. 1665–1670.
10. Kozowska M. Chemical composition and antibacterial activity of some medicinal plants from Lamiaceae Family / M. Kozowska, A. Laudy, J. Przyby, M. Ziarno, E. Majewska // Acta Poloniae Pharmaceutica & Drug Resear. — 2015. — Vol. 72, Iss. 4. — P. 757–767.
11. Государственная фармакопея Республики Казахстан. — Алматы: Изд. дом «Жібек жолы», 2014. — Т. 3. — 872 с.
12. Remigius C. Biodiversity within Melissa officinalis: Variability of Bioactive Compounds in a Cultivated Collection / C. Remigius, L. Ulrike, F. Chlodwig // Molecules. — 2018. — Vol. 23. — P. 294. doi 10.3390/molecules23020294
13. Mimica-Dukic N. Antimicrobial and antioxidant activities of Melissa officinalis L. (Lamiaceae) essential oil / N. Mimica- Dukic, B. Bozin, M. Sokovic, N. Simin // Acta Pol. Pharm. — 2003. — Vol. 60, Iss. 6. — P. 467–470.
14. Weidner C. Melissa officinalis extract induces apoptosis and inhibits proliferation in colon cancer cells through formation of reactive oxygen species / C. Weidner, C.M. Rousseau, A. Plauth, S. Wowro, C. Fischer, H. Abdel-Aziz, S. Sauer // Phytomedicine. — 2015. — Vol. 22, Iss. 2. — P. 262–270.
15. Miraj S. А review of chemical components and pharmacological effects of Melissa officinalis L. / S. Miraj, N. Azizi, S. Kiani // Der Pharmacia Letter. — 2016. — Vol. 8, Iss. 6. — P. 229–237.
16. Ceyhan N. Antimicrobial activities of different extracts of eight plant species from four different family against some pathogenic microoorganisms / N. Ceyhan, D. Keskin, A. Uğur // Journal of Food, Agriculture & Environment. — 2012. — Vol.10, Iss. 1. — P. 193–197.
17. Касымова Д.Т. Ультразвуковая экстракция как способ оптимизации технологии извлечения биологически активных веществ из растений вида Limonium gmelinii /Д.Т. Касымова, А.Б. Алиева, М.С. Жузеева, Г.Е. Жусупова // Изв. науч.-техн. общ. «КАХАК». — 2020. — № 2(69). — C. 59–67.
18. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. — М .: Медицина, 2005. — 843 с.
19. Государственная фармакопея Республики Казахстан. — Алматы: Изд. дом «Жібек жолы», 2008. — Т. 1. — 592 с.
20. Larrondo J.V. Antimicrobial activity of essences from Labiates / J.V. Larrondo, M. Agut, M.A. Calvo-Torras // Microbios. — 1995. — Vol. 82, No. 332. — P. 171, 172.
21. Болтабекова З.В. Фармакогностическое исследование по стандартизации новых лекарственных средств на основе травы мелиссы лекарственной (Melissa officinals L.): дис. … канд. фармац. наук / З.В. Болтабекова. — М., 2003. — 122 с.