Обнаружение антигенсвязывающих лимфоцитов с помощью ифа и выявление аутоантител и аутолимфоцитов к антигену кожи у больных псориазом

Особое место в диагностике инфекционных заболеваний занимает реакция выявления АСЛ (антигенсвязывающие лимфоциты). Как известно, с внедрением в организм возбудителя какой-либо инфекции начинает формироваться иммунный ответ. Возникающая при этом иммунологическая перестройка характеризуется целым каскадом клеточных и гуморальных реакций, направленных против антигенов возбудителя. На ранних этапах развития болезни это проявляется преимущественно специфической клеточной сенсибилизацией [1]. Поэтому регистрация клеточных специфических реакций по выявлению АСЛ, может служить ранним диагностическим тестом в выявлении трихомониаза. С помощью других тестов (ИФА, РПГА, РИФ и др.) диагностика осуществляется по индикации специфических антител. В опытах иммунизации и заражения различных животных показано, что АСЛ можно обнаружить в крови уже через 12 часов 4 суток после антигенного стимула, то есть значительно раньше антител. И напротив уже через 13-30 суток после введения нежизнеспособного иммуногена АСЛ в крови выявить не уДается, хотя антитела сохраняются достаточно долго после этого. Если тот же иммуноген ввести повторно на фоне выявляемых АСЛ, длительность их циркуляции в крови не увеличивается. При повторном введении иммуногена животным спустя некоторое время после исчезновения АСЛ из крови, они вновь определяются в течение периода практически той же длительности, что и после первой инъекции. Полученные результаты показывают, что в механизмах формирования АСЛ имеет значение феномен иммунологической памяти. Тест АСЛ кроме ранней диагностики можно использовать для контроля эффективности лечения инфекционных заболеваний, так как АСЛ перестают обнаруживаться существенно быстрее, чем исчезают антитела и быстрее негативации ПЦР [2].

Актуальность: Выявление АСЛ с помощью микроскопирования мазков трудоемкий процесс. В одном образце должно быть подсчитано не менее 700 лимфоцитов, на что тратится в среднем 60 мин. В оценке результатов часто играют роль субъективные факторы и технические погрешности. Механическое наслоение лимфоцитов и эритроцитов без взаимодействия клеток дает эффект «розетки» (часто засчитываться как положительный результат), не активный эритроцитарный диагностикум, гемолизированная кровь, неправильно выбранное время экспозиции мазка с ингредиентами, плохо обезжиренное предметное стекло, толстый и неравномерный мазок, плохое освещение все эти факторы плохо контролируются в ходе постановки реакции. Наслоение ошибок ведет к неправильным выводам. Стандартизировать результаты выявления АСЛ под микроскопом фактически невозможно. Часто с одной и той же пробой получают совершенно разные результаты. Видимо по этой причине при диагностике сифилиса чувствительность теста у некоторых исследователей [1] достигала 97 %, а у А.К. Утегеновой [3] по сравнению с другими реакциями она была наихудшей и составляла всего около 60 %. Такие неоднозначные выводы по диагностической эффективности выявления АСЛ являются результатом ошибок на конечном этапе постановки реакции при подсчете «розеток» под микроскопом.

Целью работы явилось совершенствование иммунодиагностики на основе выявления антигенсвязывающих лимфоцитов.

Для этого были определены следующие задачи 1. Разработать АСЛ с применением инструментального (ИФА) считывания результатов реакции 2.Применение разработанного метода обнаружения АСЛ у больных псориазом.

Известно, что к хорошо стандартизированным тестам относится ИФА, так как результат реакции считывается на приборе и выдается в цифрах. В ИФА обычно выявляют антитела, находящиеся в растворе. Мы полагали, что, если специфические рецепторы АСЛ перевести в раствор, то с такой пробой можно проводить ИФА по классической схеме. Для этого предварительно выделенные на фикколверографине лимфоциты, необходимо лизировать. Все специфические рецепторы АСЛ, находящиеся в лимфоцитах или на их поверхности, перейдут в раствор. Затем такой лизат, подобно сыворотке крови, можно использовать в обычной постановке ИФА. Учет результатов будет проводиться по уровню оптической плотности, точно также как в ИФА. В качестве лизирующего раствора сравнивали 0,5 %, 1,5 % и 3 % растворы гидроокиси натрия и 1 %, 2 % растворы тритон-100. Так как буферная емкость сыворотки достаточна высокая, что могло исказить результаты опытов, использовали глобулин, выделенный с помощью этилового спирта. Затем его растворяли 0,85 % раствором хлорида натрия и доводили до исходного объема. Полный лизис лимфоцитов наблюдали при использовании 1,5, 0,75, 0,25 % раствора гидроокиси натрия в смеси при 5 и 7 минутной экспозиции. Клетки лизировались хуже при использовании раствора тритон-100. Поэтому в дальнейшей работе применяли 3 % раствор гидроокиси натрия (1,5 % в смеси) и 5-минутную экспозицию. Полная схема выявления АСЛ с помощью ИФА: выделяли лимфоцитыраствора фиккол-верографин (уд.вес. - 1,077). Пробирки центрифугировали 1500 об/мин. в течение 40 мин. Собирали лимфоцитарную взвесь (1,0 мл) находящуюся в надосадке и дважды отмывали от остатков фикколверографина 2,0 мл 0,85 % раствором хлорида натрия. К осадку лимфоцитов добавляли 0,2 мл 0,85 % раствора хлорида натрия, встряхивали и использовали для получения лимфоцитарноголизата. В 1,0 мл плазмы в норме примерно 400000-600000 лимфоцитов. Это же количество лимфоцитов в конечном итоге находилось и в 0,2 мл лимфоцитарной взвеси. К этому объему добавляли 0,2 мл лизирующего раствора (3 % гидроокиси натрия), встряхивали и через 5 мин. доливали 0,2 мл нейтрализующего рН 3 % раствора соляной кислоты. Из полученного объема лизата 0,6 мл в реакции использовали 0,1 мл, что соответствует примерно 100000 лимфоцитов. Выделенный лизат изучали на наличие рецепторов в обычной постановке ИФА.Проводили исследования по выявлению аутоантител и АСЛ у больных псориазом к антигенам кожи человека. Сравнивали в качестве антигенного материала для сенсибилизации лунок планшет ИФА растворимую и нерастворимую фракции (табл.1). Более активная оказалась растворимая фракция кожи, полученная с помощью экстрагирования первичного материала кожи кислым буфером. Применение кислого буфера для экстрагирования антигенов кожи предпочтительнее и потому, что антигены HLA в кислой среде рН-3,0 в течение 30 минут полностью разрушаются. Поэтому, при таком экстрагировании антигены HLA в данной тест-системе не активны. Следовательно, неспецифические результаты за счет возможных антител к антигенам HLA отсутствуют.

Таблица 1 Уровень аутоантител у больных псориазом к антигену кожи (Х+m)

У всех 10 больных спсориатической артропатией ОП в ИФА была в пределах 0,248-0,837. При контрольных значениях у здоровых лиц 0,154+0,01. Из 9 больных с псориатической эритродермией только у 2-х антитела не выявлялись. Интересно, что у одного из этих больных была обнаружена ВИЧ-инфекция, а второму проводилась активная иммуносупрессивная терапия метатрексатом.

Таблица 2 Содержание аутолимфоцитов у больных артропатическим псориазом и доноров, (Х+m)

У остальных больных уровень аутоантител колебался в диапазоне от 0,308 до 0,860 ед. Ни у одного донора аутоантитела к растворимому антигену кожи не были обнаружены.

Изучалось состояние клеточного аутоиммунитета по выявляемому уровню специфических АСЛ к антигенам кожи у больных псориазом до лечения с помощью разработанного способа (табл.2). Среднее значение оптической плотности в ИФА по аутолимфоцитам у больных с псориатическойартропатией до лечения составило 1,601+0,21 и было существенно выше, чем у здоровых лиц (р<0,001)значений установленных в группе контроля- 205+0,1. Причем у некоторых больных (Т. и А.) значения были очень высокие (2,633 и 2,523), что соответствует 8,3 и 8,7% АСЛ. Корреляционный анализ, проведенный между значениями ОП в ИФА по аутолимфоцитам и PASI выявил прямую связь (r=0,54 mr=0,26). Чем выше PASI, тем выше значения оптической плотности в ИФА по аутолимфоцитам. Вывод: таким образом, разработан эффективный и простой способ обнаружения АСЛ. Выявляемые специфические аутоантитела и аутолимфоциты к дерме больных псориазом могут быть маркерами аутоиммунитета и использоваться в качестве диагностического лабораторного показателя для назначения иммунодепрессантов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Капкаев Р.А., Исмаилова Г.А., Гариб Н.Ф. и др. Новые подходы к проблеме ранней диагностике сифилиса // Новости дермататологии и венерологии. 1998. №2. С.32-33.
2. Каральник Б.В. Природа и диагностическое использование антигенсвязывающих лимфоцитов // Международная научная конференция .Астана: 2005. С. 45-48.
3. Утегенова А.К. Сравнительная оценка различных методов диагностики сифилиса у беременных, рожениц и новорожденных: автореф. ... канд.мед.наук Алматы, 2004. 36 с.