АННОТАЦИЯ
В статье представлена методика определения в плазме крови человека гипотензивного лекарственного средства бисопролол с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Аналитический диапазон методики составил 8,45-4225,20 нг/мл и позволяет проводить количественное определение бисопролола при исследованиях фармакокинетики, терапевтическом мониторинге, допинг-контроле, анализе острых отравлений и в судебно-химической практике.
Ключевые слова: бисопролол, ВЭЖХ-МС/МС, гипотензивные лекарственные средства, биоаналитические исследования, острые отравления
Цель исследования.
Бисопролол включен в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, утвержденный Правительством Российской Федерации на 2014 год и в Государственный Реестр лекарственных средств Республики Казахстан, что делает его одним из самых часто применяемых препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Целью исследования являлась разработка методики определения бисопролола в плазме крови человека с помощью метода
ВЭЖХ-МС/МС, пригодной для проведения исследований фармакокинетики, терапевтического лекарственного мониторинге, допинг-контроля, анализа острых отравлений и в судебно-химической практике.
Материалы и методы.
Для определения бисопролола при проведении биоаналитических исследований используются различные аналитические методы, в первую очередь хроматографические.[1-4] Ранее была продемонстрирована невозможность применения таких методов, как тонкослойная хроматография (ТСХ) и газовая хроматография (ГХ) без дериватизации для количественного определения бисопролола. [5, 6] Таким образом, для количественного определения бисопролола в плазме крови человека был выбран метод ВЭЖХ-МС/МС.
При разработке методики и при количественном определении образцов плазмы больных с острыми отравлениями пробоподготовку проводили с помощью осаждения белков ацетонитрилом. Для этой цели к 500 мкл плазмы больных или к 400 мкл чистой плазмы с добавлением 100 мкл стандартного раствора бисопролола до получения концентраций 8,45, 42,25, 84,50, 422,52, 845,04, 2112,60 и 4225,20 нг/мл, прибавляли 700 мкл ацетонитрила, встряхивали в течение 30 с на шейкере, далее центрифугировали в течение 15 минут со скоростью 13500 об/мин, надосадочную жидкость отбирали в виалы объемом 1,5 мл.
Количественное определение полученных проб проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе LCMS-8040, SHIMADZU CORPORATION, Япония, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок и образцов, дегазатором, автосамплером, тандемным масс-спектрометрическим детектором. Обработку данных проводили при помощи программного обеспечения LabSolutions (Ver. 5.3), SHIMADZU CORPORATION, Япония. Подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты и 1 ммоль/л формиат аммония в воде, (А) /0,1% раствор муравьиной кислоты и 1 ммоль/л формиат аммония в метаноле (Б) (40:60). Скорость потока подвижной фазы: 0,8 мл/мин. Неподвижная фаза: хроматографическая колонка Zorbax Eclipse Plus C18 150*4,6мм 5 мкм с предколонкой Zorbax Eclipse Plus C18 12,5*4,6мм 5 мкм, при температуре 40оС. Объем вводимой пробы: 10 мкл. Время хроматографирования: 15 мин. Детектирование: мониторинг множественных реакций (multiple reactions monitoring, MRM), режим положительной ионизации, ион-предшественник m/z 326,30, дочерние ионы m/z 222,20 и m/z 116,1. Время удерживания бисопролола: около 6,5 мин.
Результаты и обсуждение.
Разработанная методика определения бисопролола в плазме крови человека была валидирована на основе руководств FDA, ЕМА и руководства по экспертизе ЛС под ред. А. Н. Миронова (том I). [7] По результатам проведенной валидации методика демонстрирует селективность. Линейный диапазон методики составляет 8,45-4225,20 нг/мл плазмы (Рис. 1). Коэффициент линейной корреляции составил 0,9999.
При определении правильности и прецизионности на уровнях intra-day и inter-day относительная погрешность и относительное стандартное отклонение не превышали 7,72% и 11,47%, соответственно. Полученные значения укладываются в норму (не более 20% для нижних точек диапазона линейности и не более 15% для остальных точек).
На рисунке 2 продемонстрирован пример определения концентрации больного, госпитализированного с подозрением на острое отравление гипотензивными лекарственными средствами. С помощью предложенной методики была определена концентрация бисопролола в плазме крови, она составила 51,51 нг/мл, что соответствует максимальной терапевтической концентрации бисопролола в плазме и может наблюдаться при острых отравлениях спустя несколько часов после приёма препарата.
ВЫВОДЫ.
Разработанная методика количественного определения бисопролола в плазме крови методом ВЭЖХ-МС/МС. По результатам проведенной валидации данная методика линейна, демонстрирует правильность и прецизионность измерений в диапазоне 8,45-4225,20 нг/мл, что позволяет применять её для решения таких задач как
ЛИТЕРАТУРА
- K. Czerwinska, E. Wyszomirska, T. Kaniewska. Identification and determination of selected medicines reducing hypertention by densitometric and gas chromatographic methods // Acta Poloniae Phurmaceutica - Drug Research. 2001. № 58 (5). P. 331-338.
- Comparison of the analysis of в-blockers by different techniques / E. Pujos et al. // Journal of Chromatography B. 2009. № 877. P. 4007-4014.
- LC-MS/MS method for the determination of several drugs used in combined cardiovascular therapy in human plasma / Oskar Gonzalez et al. // Journal of Chromatography B. 2010. № 878. P. 2685-2692.
- Development of an LC-MS/MS method for the quantitation of 55 compounds prescribed in combined cardiovascular therapy / Oskar Gonzalez et al. // Journal of Chromatography B. 2011. № 879. P. 243-252.
- Е.С. Мельников, М.В. Белова Разработка методики лабораторной диагностики острых отравлений гипотензивными лекарственными средствами // Сеченовский вестник. - Москва, 2012. - №3 (9). С. 4649.
- Е.С. Мельников, М.В. Белова, Г.В. Раменская. Анализ острых отравлений некоторыми гипотензивными лекарственными веществами методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии // Масс-спектрометрия. 2014. Т. 11. № 2. С. 81-88.
- Руководство по экспертизе лекарственных средств под ред. проф. А. Н. Миронова. Том I. / М.: Гриф и К, 2013.