Насущной задачей земледелия является его экологизация, которая включает использование ресурсов почвы для сохранения и увеличения их плодородия. Подходы к решению задачи, в частности, заключаются в использовании микробной компоненты почвы. Привлекательна в этом плане непременная и многочисленная группа фото-трофных микроорганизмов - цианобактерий. Прежде всего, внимание к ним привлечено благодаря азотфиксации и широкому спектру адаптации к различным почвенным и гидротермическим условиям. В связи с этим начато изучение возможностей использования цианобактерий как консортов сложных микробных сообществ. Цианобактерии могут образовывать стойкие консорциумы с микроводорослями [1, 2, 3, 4].
Целью данной работы было исследование и идентификация цианобактерий, выделенных из рисовых чеков Карауктибинского опорного пункта Казахского НИИ рисоводства им. Ибрая Жахаева Кызылординской области и создание на их основе консорциумов для получения эффективных биопрепаратов используемых в агро-биотехнологии.
Материалы и методы исследований
Объект исследований для данной работы послужили пробы, отобранные на рисовых полях Карауктибинского опорного пункта Казахского НИИ рисоводства им. Ибрая Жахаева Кызылор-динской области, а также водные пробы из Ис-сыкского озера и с горячего источника Тургень Енбекшиказахкого района Алматинской области.
А также использовали штаммы Chlorella vulgaris Z-1, Ankistrodesmus falcatus взятые из коллекции лаборатории фототрофных микроорганизмов кафедры биотехнологии Казахского Национального Университета им. Аль-Фараби.
Полевые наблюдения и сбор материала производили с марта по июнь 2012 г.
На одном и том же участке производился отборов проб с различной глубины. Отобранные пробы были доставлены в лабораторию с соблюдением всех требований к перевозке отобранного материала.
Определение видового состава микроводорослей в пробах из различных водных экосистем проводили по методике Сиренко с использованием определителей для сине-зеленных водорослей [5, 6, 7, 8].
Для выделения альгологически чистой культуры из накопительной использовали обычные микробиологические методы - разделения, пересевов. Для оценки активности водорослей использовались альгологически и бактериологически чистые формы [9, 10].
Для проверки на чистоту, культуры пересевались на стерильный 0,25 % мясной бульон. По помутнению бульона определяли чистоту культуры.
Определение оптической плотности и динамику роста на разных синтетических средах проводилось в течении 7 суток на спектрофотометре PD-303 (Япония). Микрофотосъемка производилась на цифровой фотоаппарат CANON PowerShot A 800 Silver.
Результаты исследований и обсуждение
В ходе проведенных исследований были выделены 4 бактериологически чистые культуры цианобактерий, которые идентифицированы как представители родов Anabaena sp^-1, Spirulina sp.K-1,Oscillatoria sp.K-1 и Nostoc sp.K-1.
1.Nostoc sp.K-1
Относится к группе цианобактерий, класс Hormogeneae, порядок Nostocales, род Nostoc. Трихомы одиночные, прямые, состоят из шарообразных клеток, среди которых встречаются гетероцисты и реже акинеты. Для культивирования используется среда Громова. Хорошо растут при температуре 250-300С. (1-рисунок, а).
2. Spirulina sp.K-1
По систематическому положению относятся к цианобактериям, класс Hormogeneae, род Spi-rulina. нитчатые. Клетки образуют правильные спирали. Трихомерысветлые, сине-зеленые, их диаметр 1-2 мкм, расстояние между спиралями 2,7-5 мкм. В основном, растут, образуя скопления на стенках посуды. Хорошо растут при температуре 250-300С в среде Заррука на свету (1-ри-сунок, в).
3.Oscillatoria sp. K-1
Трихомы синевато-зеленого цвета, прямые, у поперечных перегородок не перешнурованные, к концам не утонченные, длина больше ширины. Выделены на питательной среде Громова. Для культивирования используется среда Громова. Оптимальный рост происходит при температуре 250-280С (2-рисунок, а).
4. Anabaena sp. K-1
Относится к группе цианобактерий, класс Hormogeneae, порядок Nostocales, род Anabaena. Трихомы одиночные, очень часто в клубках, состоят из шарообразных клеток, среди которых встречаются гетероцисты и реже акинеты. Трихомы своим строением очень напоминают трихомы ностока. Большей частью они спирально или кольцеобразно свернуты, реже прямые. Для культивирования используется среда Громова. Оптимальный рост происходит при температуре 250-300С (2-рисунок, в).
Влияние азота на рост выделенных штаммов цианобактерий
В дальнейшем, с целью проведение скрининга полученных бактериологически чистых культур цианобактерий по способности азотфикса-ции, все выделенные культуры цианобактерий выращивали на среде Громова без добавления источника азота. Для этого изучалось влияние данного элемента на их динамику роста.
Результаты опыта показали, что из всех выделенных цианобактерий (Spirulina sp.K-1, Anabaena sp.K-1, Oscillatoria sp.K-1) наибольшей активностью роста клеток обладает культура Anabaena sp.K-1 (3-рисунок). Рост клеток культур Spirulina sp. K-1 , Oscillatoria sp. K-1 в среде без азота был на много ниже в сравнение с ростом культуры Anabaena sp.K-1.
Экспериментальные данные свидетельствуют о высокой продуктивности культуры Anabaena sp.K-1 на питательной среде, без добавления азота. При сравнении роста культур Spirulina sp. K-1 и Oscillatoria sp.K-1 на двух средах показано, что на среде с отсутствием азота наблюдается наименьший прирост биомассы. Полученные результаты позволяют предполагать, о том, что культура Anabaena sp.K-1 получает азот путем его связывания из атмосферы. Штамм Anabaena sp.K-1 характеризуется высокой скоростью роста в безазотистой среде, что коррелирует с большой частотой образования гетероцист и высокой активностью нитрогеназы.
Известно что, цианобактерии - одни из немногих живых существ, способных фиксировать атмосферный азот, переводя его в доступную для всего живого форму.
Использование в агробиотехнологии азото-фиксирующих цианобактерий может решить проблемы структуризации, плодородия почв, соответственно, увеличить урожайность сельскохозяйственных растений.
Влияние рН среды на рост клеток циано-бактерии Anabaena sp.K-1
Цианобактерии подвергаются воздействию целого ряда экологических факторов, важнейшими из которых являются температура, pH и реакция среды.
Для достижения высоких результатов при культивировании цианобактерий показатель рН среды должен быть оптимальным для их роста. При приготовлении питательных сред необходимо вести контроль за концентрацией ионов водорода. Кислотность воды является лимитирующим фактором. Устойчивость разных таксонов к изменениям кислотности различна. Для многих цианобактерий характерна нейтральная либо слабощелочная среда, оптимальный показатель рН среды составляет 7,0 -7,6. Кислотность среды влияет на устойчивость компонентов питательной среды, на их доступность для живых организмов, в особенности на усвояемость факторов роста, витаминов.
Изучено влияние реакции среды в диапазоне от 2 до 10 с интервалом 2 на клетки цианобак-терии Anabaena sp. К-1.Культуру цианобактерии выращивали на жидкой питательной среде Громова. Необходимые для эксперимента значения рН получали с использованием концентрированной щелочи (КОН) или кислоты (НС1). При определении использовали рН метр. Градиент рН в незабуференной среде задавали в начале опыта и далее не корректировали.
Результаты испытаний роста штамма циано-бактерии на питательных средах с разными значениями рН показали, что оптимальное значение рН для исследованной культуры составляет в пределах 6-8 (4-рисунок).
При значении рН среды 2 наблюдалось полное разрушение клеточного содержимого. Сдвиг рН среды в сторону подщелачивания от 2 до 4 и от 8 до 10 вызывали изменение формы у 5060% клеток с эллипсоидной на круглую, повреждения клеточных стенок, а также происходило обесцвечивание цитоплазмы. В диапазоне рН от 6 до 8 клетки сохраняли морфологический статус (5-рисунок).
Таким образом, область значений рН от 6 до 8 была наиболее оптимальной для роста клеток
Anabaena sp. К-1, при изменении рН среды в сторону кислой среды наблюдалось изменение морфологии клеток. А при рН свыше 8 число неподвижных, разрушенных клеток резко возрастало.
Создание консорциума цианобактерий и микроводорослей, определение их динамики роста
Для создания консорциумов выбрана азот-фиксирующия цианобактерия с наибольшей азотфиксирующей активностью Anabaena sp. К-1. И взяты три культуры микроводорослей Nos-toc calsicola, Ankistrodesmus falcatus и Chlorella vulgaris из коллекции лаборатории фототрофных микроорганизмов кафедры биотехнологии
Казахского Национального Университета им. Аль-Фараби.
Вначале исследовали динамику роста всех четырех культур в течении 7 суток.
Из таблицы видно, что максимальный прирост биомассы на седьмые сутки культивирования наблюдался у культуры микроводорослей Chlo-rella vulgaris. Чуть меньше Nostoc calsicola и Anabaena sp. Были созданы четыре ассоциации Nostoc calsicola - Ankistrodesmus falcatus и Nostoc calsicola - Chlorell vulgaris; Anabaena -Ankistrodesmus falcatus и Anabaena - Chlore-lla vulgaris. Консорциумы цианобактерий и микроводорослей выращивались в течении 7 суток.
Из рисунка 6 видно, что Ankistrodesmus falca-tus сильно подавляет рост цианобактерий. Хороший рост показали два консорциума^^^ cal-sicola - Chlorella vulgaris и Anabaena - Chlorella vulgaris.
Особая ценность этих консорциумов в том, что штаммы Anabaena sp. К-1 и Nostoc calsicola защелачивают среду до рН 8 ,а под действием микроводоросли Chlorella vulgaris рН менялась в сторону нейтральной, при культивировании консорциума Nostoc calsicola - Chlorella vulgaris через 3 суток, а консорциума Anabaena sp. К-1 -Chlorella vulgaris через 4 суток.
Было проведено микроскопическое исследование искуственного консорциума на основе цианобактерий и зеленых водорослей их морфологии (7-рисунок). Показана возможность консорциумов при совместном культивировании исследуемых штаммов.
Таким образом созданы два новых консорциума цианобактерий и микроводорослей (Anabaena sp. - Chlorella vulgaris и Nos-toc calsicola с- Chlorella vulgaris), которые могут быть предложены для использования в агробиотехнологии для обогащения почв связанным азотом, а также для регуляции рН среды (нейтрализации).
Литература
- Панкратова Е.М., Калинин А.А. Цианобактерии как возможные организмы для создания бактериальных препаратов // Роль научн. исслед. в развитии сельского хозяйства. производства Кировской области. Киров, 1991. - С.25-33.
- Калинин А.А. Цианобактерии как возможные компоненты дизатрофных микробных ассоциаций и их влияние на растения: Автореферат.дисс. канд.биол. наук. М., 1995. - 23 с.
- Ковина А.Л. Микробные агроконсорциумы на основе цианобактерий: Автореферат.дисс. канд. биол. наук М., 2001.-23 с.
- Панкратова Е.М., Зяблых Р.Ю., Калинин А.А., Ковина АЛ., Трефилова Л.В. Конструирование микробных культур на основе синезеленой водоросли Nostocpa1udosumKiitz.il Альгология,2004. Т.14 №4.-С.445-458.
- Сиренко Л.А., Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Лукина Л.Ф. и др. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. - Киев: Наука думка, 1975. -247с.
- Эргашев А.Э. Определитель протококковых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1979. -Ч.І. - 343с.
- Эргашев А.Э. Определитель протококковых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1979. -Ч.ІІ. -383с.
- Овсеникова М. Н. Методы получения бактериологически чистых культур одноклеточных зеленых водорослей // Бот.журн. - 1971. - №58. - С.1141-1147.
- Заядан Б.К., Өнерхан Г. Микробалдырлардың таза дақылдарын бөліп алу және оларды белсенді өсіру тәсілдері. - Көкшетау, 2008. - 95 б.
- Заядан Б.К., Акмуханова Н.Р., Садвакасова А.К Коллекция микроводорослей и методы их культивирования. - Алматы, 2013. - с. 158.