Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Получение конструкций, обеспечивающих контролируемое усиление генов в трансгенных растениях

Компьютерный анализ показал, что мРНК стрессовых белков (в условиях гипертермии или гипоксии) таких как белки теплового шока (HSP) или ген алкогольдегидрогеназы (Adh),  транслируются намного эффективнее, чем при обычных физиологических условиях. Этим они обязаны энхансерным участкам, входящим в состав их лидерных последовательностей /1/. В дополнение к этому, экспрессия генов активируется только при стрессовых условиях в виду наличия регуляторных областей в участке промотора (HSEилиARE) /2, 3/. Учитывая эти особенности конструкций в настоящее время, все больше расширяется поле их практического применения.  Одним из направлений является получение трансгенных растений с встроенными целлюлазными генами  для использования их в производстве биоэтанола.

На сегодня самым экономичным способом получения этанола из растительного сырья считается одновременный ферментативный гидролиз целлюлозы и  гемицеллюлозы с последующей ферментацией получаемых свободных сахаров до этанола. В настоящее время  все чаще предлагается  новая технология экспрессии генов целлюлазы, выделенных из чистых штаммов гриба Lentinullaedodes (более известны как грибы Shiitake), способных к переработке растительной биомассы (отходы с/х производства, таких как солома злаков, опилки и т.д.) до простых сахаров. Полученные сахара в дальнейшем используются как сырье для промышленного получения биоэтанола. Сегодня в ведущих компаниях мира  рассматриваются возможности, и проводятся эксперименты по получению трансгенных растений, способных при определенных условиях (повышенные температуры до 370С)  после скашивания и  укладки в емкости, запускать синтез ферментов (целлюлаз). В результате работы встроенных генов, ферменты расщепляют целлюлозу до свободных сахаров с последующим сбраживанием до этанола /4/.    

Целью настоящих исследований является создание модельных конструкций, обеспечивающих контролируемый синтез фермента целлюлазы 7А из гриба Lentinulaedodes (Shiitake).

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования послужили синтетические трансляционные энхансеры, минимальный 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты, элемент теплового шока, репортерный ген β-глюкурунидазы (GUS) и ген фермента целлюлазы 7А из гриба Lentinulaedodes. Конструкции, были созданы путем вставки в плазмиду pCAMBIA 2300 кассеты, содержащей элемент теплового шока из плазмиды pSGH2 и минимального 35S-промотора (-60) вируса мозаики цветной капусты по сайтам рестрикции HindIIIи NcoI. Так же по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI в плазмиду был добавлен терминатор нопалин синтазы (NOS-terminator), ответственный за сигнал полиаденилирования.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Большое внимание в течении 30 последних лет уделено изучению потенциала термофильных бактерий типаClostridium thermocellum и Clostridium thermosaccharoliticum, которые продуцируют свои активные целлюллазы и гемицеллюлозы для переработки целлюлозы при высоких до 600С температурах. Однако целлюлазные системы этих бактерий имеют достаточно сложный механизм  ферментации и поэтому в настоящее время говорить об использовании этих систем в промышленном производстве биоэтанола преждевременно. Наиболее отработанными сегодня являются системы (конструкции) переработки целлюлозы, в которых используются гены целлюлолитических ферментов, выделенные из грибов в основном из штамма грибов Lentinulla edodes (Shiitake) и  Trichoderma reesei /4/.

К настоящему времени установлено, что фермент, известный как “cellulase” действительно является комплексом ферментов (целлюлозная  ферментная система), в который входит три  основных компонента  для переработки нативной целлюлозы.

  • Эндоглюканазы (endo-ß-glucanase (EC 3.2.1.4) – случайные (не целевые) действия на растворимые и полисахаридные цепи.
  • Экзоглюканазы (exo-ß-glucanase (EC 3.2.1.91) - включают целлобиогидролазы (cellobiohydrolases), которые отщепляют целлобиозу или глюкозу от концов целлюлозной цепочки.
  • Β-глюкозидазы - (ß-glucosidase (EC 3.2.1.21), которые освобождают D-глюкозу от димеров целлобиозы и экзоглюкозидазы (exoglucosidases), которые предпочтительно гидролизируют растворимые целлодекстрины.

Как показала практика, одна из  активных   целлюлозных   ферментных систем  содержится в штаммах гриба  Lentinulla edodes (Shiitake). Это  экономически важная группа грибов, которая издана  используется в пище и в медицине. Традиционно грибы выращивают на свежих обрезках древесины. Грибы использует в качестве питательных веществ целлюлозу и гемицеллюлозу, извлекая их из гниющей древесины. Таким образом, разнообразие ферментов, продуцируемых грибами, может быть успешно использовано для переработки биомассы  с последующим получением биоэтанола. На сегодня уже клонированы 2 целлюлазных гена из штамма этого гриба (cel 7A иcel 6B). Описана экспрессия этих генов для различных источников углерода и продемонстрировано, что оба гена  активизируются в присутствии кристаллической целлюлозы /4/. 

Для обеспечения контролируемого синтеза нам необходим был минимальный 35S-промотор, который сам по себе не может обеспечивать экспрессию гена, перед которым он находится. Для экспрессии ему необходим некий помощник (helper). В качестве такого помощника нами был выбрана кассета плазмиды pSGH2, содержащая восьмикратный бинаправленный повтор области промотора теплового шока (HSE). По обеим сторонам этого элемента находится ТАТА боксы, перед элементом «HSE» находится промоторы T7 и Sp6 /3/. В данную кассету по сайтам рестрикции ферментов BamHI и SalI был клонирован минимальный 35S-промотор.

В связи с этим в наших экспериментах были созданы следующие конструкции:

Первая конструкция, (контроль) - HSE-35Smin-GUS-NOS-pCAMBIA, не содержащая никаких трансляционных энхансерных последовательностей, была получена путем вставки в пустую плазмиду pCAMBIA, кассеты с элементом теплового шока и минимального 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, репортерного гена, кодирующего фермент β-глюкуронидазу (GUS) и терминатор нопалин синтазы (NOS-terminator), ответственного за сигнал полиаденилирования (элемент мРНК растений, защищающий от рибонуклеаз и проявляющий некий энхансерный эффект /5/).

Вторая конструкция - HSE-35Smin-115х3-GUS-TMV-NOS-pCAMBIA была ранее получена с помощью вставки в плазмиду pl-GUS по рестрикционным сайтам HindIII и NcoI ДНК фрагмента, который содержит трехкратный повтор 10 нуклеотидной последовательности повторяющий внутренний район 18S рРНК растений с 1115 по 1124 нуклеотид (последовательность ARC-1 /6/). Затем по сайтам рестрикции BamHIи NdeI в 3’-конец была вставлена 3’- нетранслируемую последовательность вируса табачной мозаики (TMV).   Для приближения мРНК к растительным, по сайтам NdeI и EcoRI в каcсету 115х3-GUS-TMV был добавлен терминатор нопалин синтазы (NOSterminator), ответственный за сигнал полиаденилирования /5/.

Третья конструкция - HSE-35Smin-115х3-Cell7A-TMV-NOS-pCAMBIA была получена с помощью замены репортерного гена GUS по сайтам рестрикции NcoI и Cfr9I на ген целлюлазы 7А из гриба Lentinulaedodes(рисунок 1) /4/.

А – контроль, состоящий из элемента теплового шока (HSE), минимального 35S CaMV-промотора, репортерного гена (GUS) и терминатора нопалин синтазы (NOS). Б – конструкция, отличающаяся от  контроля содержанием энхансерной последовательности (3хARC-1), В – конструкция, в которой репортерный ген GUSбыл заменен на ген фермента целлюлазы из гриба Lentinulaedodes;

 

 

Кассеты, обеспечивающие контролируемую экспрессию гена

Конструкции, различающиеся по наличию или отсутствию энхансерных последовательностей были клонированы в бинарную плазмиду pCAMBIA2300.

Проверка плазмид на наличие интересующих нас ДНК-фрагментов, осуществлялась методом рестрикции /7/.

Проверка конструкции HSE-35Smin-GUS-NOS-pCAMBIA(контроль) была проведена с методом обработки плазмиды рестриктазами HindIII и NcoI. В этом случае из данной плазмиды мы вырезали кассету, содержащую элемент теплового шока и минимальный 35S-промотор. Длина данного фрагмента примерно 550 пар оснований (п.о.). поскольку в данной плазмиде имеются два сайта рестрикции NcoI, дополнительно вырезается фрагмент длиною 3500 п.о., содержащий репортерный ген β-глюкурунидазы (GUS), терминатор нопалин синтазы (NOS-ter) и промотор нопалин синтазы (NOS-pro), ответственный за экспрессию маркерного гена (устойчивость к канамицину).

Конструкция  HSE-35Smin-115х3-GUS-TMV-NOS-pCAMBIAбыла проверена с помощью эндонуклеаз HindIII и NcoI. Данной конструкции элемент теплового шока, минимальный 35S-промотор и энхансерная последовательность объединены в один фрагмент, продукт рестрикции должен быть порядка 650 п.о. (HSE-35Smin – 550 п.о., 115x3 – 80 п.о.).

Третья конструкция  HSE-35Smin-115х3-Cell7A-TMV-NOS-pCAMBIA была обработана рестриктазами HindIII и NcoI для вырезания фрагмента HSE-35Smin-115x3. В рестрикционную смесь был добавлен фермент Cfr9I для вырезания гена целлюлазы 7А  длинною в 1571 п.о.

Результаты рестрикции были проанализированы с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле (рисунок 2) /7/.

Проверка конструкций рестрикционным анализом 

Из рисунка 2 видно, что в случае контроля элемент теплового шока и минимальный 35S-промотор имеют длину в 550 п.о. В случае, где присутствует энхансерная последовательность 115х3, длина фрагмента увеличилась и составляет порядка 650 нуклеотидов. При рестрикционном анализе конструкции HSE-35Smin-115х3-Cell7A-TMV-NOS-pC длина фрагмента,  содержащий элемент теплового шока, минимальный 35S-промотор и энхансерную последовательность 115х3 составляет 650 п.о., и из плазмиды был вырезан ген целлюлазы 7А, длинною 1571 п.о.

В результате исследования были получены ДНК-конструкции, обеспечивающие высокую экспрессию гена и выход белка при помощи трансляционных энхансерных последовательностей.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке. // Цитология, 2001, Т.42. №4. C. 323-342.
  2. Bailey-Serres J., Dawe R.K. Both 5’- and 3’-sequenses of Maize adh-1 mRNA are required for enhanced translation under low oxygen conditions.//Plant physiol., 1996, Vol.112. P. 685-695.
  3. Nover L., Neumann D., Sharf K-D. Heat shock and other stress response systems of plants// Results and problems in cell differentiation. 1989, Vol.16: P. 156-170.
  4. Charles C. Lee, Dominic W.S. Wong, George H. Robertson. Cloning and characterization of two cellulase genes from Lentinula edodes and Trichoderma reesei// FEMS Microbiology Letter, 2005 (2001), P.355-360.
  5. Gallie D.R. The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency // Genes Devel., 1991, Vol.5. –Р.2108-2116.
  6. R. Zh. Akbergenov, S. Sh. Zhanybekova, R. V. Kryldakov, A. Zhigailov, N. S. Polimbetova, T. Hohn and B. K. Iskakov. ARC-1, a sequence element complementary to an internal 18S rRNA segment, enhances translation efficiency in plants when present in the leader or intercistronic region of mRNAs // Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 1, P. 239-247.
  7. Maniatis T. et al. Molecular cloning, Book I, 1989.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.