Аннотация
Проведена валидация аналитической методики количественного определения пинитола в траве клевера лугового по показателям специфичности, правильности, прецизионности и линейности. В результате было установлено, что она, выдерживает требования статьи «Валидация аналитических методик» ГФ 12 (2 тома) и пригодна для включения в нормативный документ (ФСП, ФС и т. п.).
Ключевые слова: валидация, пинитол, линейность, прецизионность, повторяемость, воспроизводимость, правильность.
Цель исследования. Для продвижения в медицинскую практику местного лекарственного растительного сырья клевера лугового в качестве гипогликемического средства нами решен комплекс вопросов, связанных с его стандартизацией [1]. Исходя из этого, что достоверная оценка качества лекарственных препаратов возможна только в результате валидирования предлагаемых методик анализа [2], целью настоящего исследования является изучение валидационных характеристик ВЭЖХ методики количественного определения пинитола для стандартизации травы клевера лугового.
Материалы и методы. Количественное содержание пинитола в траве клевера лугового определяли методом ВЭЖХ. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0,5 г (точная навеска) помещали в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляли 10 мл воды. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем извлечение профильтровывали, количественно переносили в центрифужный мерный стакан и центрифугировали со скоростью 3 тыс. об/мин в течение 5 мин. Для анализа отбирали часть супернатанта и профильтровывали через мембранный фильтр с порами размером 0,22 мкм.
В инжектор хроматографа по вводили 20 мкл растворов исследуемого и стандартного образца.
Условия хроматографирования: жидкостный хроматограф Agilent 1100 series, снабженный изократным насосом и рефрактометрическим детектором с переменной длиной волны; хроматографическая колонка размером 25 x 0,46 см, Ultrasphere-amino с размером частиц 5 мкм; подвижная фаза: смесь ацетонитрила и воды в соотношении 75:25, предварительно дегазированная и профильтрованная через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм; скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин; объем вводимой пробы - 20 мкл; время анализа – 20 мин; эффективность колонки – не менее 2000 теоретических тарелок; относительное стандартное отклонение – не более 2,0%.
Содержание пинитола в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле:
где, Sисп - площадь пика пинитола на хроматограмме раствора испытуемого образца; Sст - площадь пика пинитола на хроматограмме раствора рабочего стандартного образца; Cст - содержание пинитола в растворе рабочего стандартного образца, мг/мл; V –объем раствора испытуемого образца, мл; m - масса испытуемого образца, мг.
Приготовление раствора рабочего стандартного образца. 5 мг (точная навеска) лабораторного стандарта пинитола растворяют в 2,5 мл очищенной воды при нагревании на кипящей водяной бане. После полного растворения навески объем раствора доводят до 10 мл метанолом. Раствор используют после центрифугирования (10 тыс об/мин, 2 мин) или фильтрования через мембранный фильтр с порами размером 0,22 мкм.
Хроматограммы испытуемого раствора и раствора РСО представлены на рис. 1 и 2.
Валидация методики проводилась по параметрам: специфичность, правильность, прецизионность и линейность в аналитической области методики количественного определения.
Специфичность – это способность аналитической методики давать правильный результат определения вещества в присутствии сопутствующих компонентов [3].
Для оценки специфичности аналитической методики нами применен метод сопоставления результатов определения времени удерживания препарата с временем удерживания РСО пинитола.
В эксперименте нами был использован три партии сырья травы клевера лугового.
Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пика на хроматограмме стандартного раствора пинитола. В результате ВЭЖХ -анализа нами установлено, что время удерживания основного пика испытуемого препарата совпадает с временем удерживания пика РСО пинитола (табл. 1).
Таблица 1 - Результаты изучения времени удерживания (мин) раствора стандартного образца пинитола и сырья травы клевера лугового
|
№ |
РСО |
Партия 1 |
Партия 2 |
Партия 3 |
|
1. |
3,765 |
3,733 |
3,749 |
3,772 |
|
2. |
3,770 |
3,750 |
3,767 |
3,744 |
|
3. |
3,775 |
3,746 |
3,791 |
3,768 |
|
4. |
3,772 |
3,770 |
3,766 |
3,786 |
|
5. |
3,780 |
3,788 |
3,785 |
3,791 |
Аналитическая методика по определению специфичности препарата травы клевера лугового выдерживает требования валидации по показателю «Специфичность».
Таблица 2 - Результаты ВЭЖХ анализа РСО пинитола
|
№ |
Площадь пика |
Среднее значение |
|
1. |
331767 |
331978 |
|
2. |
332478 |
|
|
3. |
331954 |
|
|
4. |
331992 |
|
|
5. |
331701 |
|
|
Масса взятого РСО пинитола (mstd), в граммах |
0,7450 |
|
|
содержание пинитола в РСО, %; |
100 |
|
Таблица 3 - Результаты испытания правильности методики количественного определения пинитола в траве клевера лугового (партия 1)(M+tm; p=0,05; n=5)
|
№ |
Площадь пика |
Содержания, % |
Среднее значение |
|
1. |
935434 |
4,2842 |
4,3305 (4,2842÷4,3564) |
|
2. |
946248 |
4,3337 |
|
|
3. |
951213 |
4,3564 |
|
|
4. |
948357 |
4,3433 |
|
|
5. |
946556 |
4,3351 |
Таблица 4 - Результаты испытания правильности методики количественного определения препарата травы клевера лугового (Партия 2)(M+tm; p=0,05; n=5)
|
№ |
Площадь пика |
Содержания, % |
Среднее значение |
|
1. |
965465 |
4,3074 |
4,3409 (4,3074÷4,3670) |
|
2. |
972234 |
4,3376 |
|
|
3. |
973258 |
4,3422 |
|
|
4. |
978826 |
4,3670 |
|
|
5. |
975112 |
4,3504 |
Таблица 5 - Результаты испытания правильности методики количественного определения препарата травы клевера лугового (партия 3)(M+tm; p=0,05; n=5)
|
№ |
Площадь пика |
Содержания, % |
Среднее значение |
|
1. |
982654 |
4,2736 |
4,2807 (4,2600÷4,3138) |
|
2. |
991887 |
4,3138 |
|
|
3. |
985648 |
4,2867 |
|
|
4. |
979523 |
4,2600 |
|
|
5. |
981652 |
4,2693 |
Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное. Валидируемая методика признается правильной, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средним результатам анализов, полученных экспериментально по данной методике [1].
Результаты обработаны методом вариационной статистики по критерию Стьюдента при P=0,05 [1]. В таблицах приведены средние арифметические значения (M), соответствующие им стандартные ошибки среднего значения (m), критерий Стьюдента (t), количество выборок (n) и доверительные границы (нижняя доверит. граница ÷ верхняя доверит. граница) (табл.2-5).
Прецизионность методики характеризуется рассеянием результатов, получаемых с ее использованием, относительно величины среднего результата. Мерой такого рассеяния является величина стандартного отклонения результата отдельного определения, полученная для выборки достаточно большого объема [3].
Прецизионность оценивается для любой методики количественного определения по результатам не менее 5 определений для каждого из 3 уровней определяемых величин (нижнего, среднего и верхнего), лежащих в пределах аналитической области методики [3].
Повторяемость (сходимость). Повторяемость аналитической методики оценивают по независимым результатам, полученным в одинаковых условиях в одной лаборатории (один и тот же исполнитель, одно и то же оборудование, один и тот же набор реактивов) в пределах короткого промежутка времени [3].
Внутри лабораторная (промежуточная) прецизионность. Внутри лабораторная (промежуточная) прецизионность валидируемой методики оценивается в условиях работы одной лаборатории (разные дни, с вновь приготовленными реактивами и т. д.) [3].
В эксперименте нами были использованы три партии препарата травы клевера лугового.
После испытания препарата по показателю «Прецизионность», характеризующую повторяемость (сходимость) результатов количественного определения препарата, были получены следующие данные (табл.6).
Таблица 6 - Результаты испытания на прецизионность, характеризующую повторяемость результа-тов количественного определения пинитола в траве клевера лугового (M+tm; p=0,05; n=5)
|
Трава клевера лугового |
Результат |
|
Партия 1 |
4,3305(4,2842÷4,3564) |
|
Партия 2 |
4,3409(4,3074÷4,3670) |
|
Партия 3 |
4,2807(4,2600÷4,3138) |
Если сравнить результаты испытания препарата в трех разных партиях, то окажется, что между ними нет статистически достоверной разницы, т.е. результаты трех партий сопоставимы.
Данные испытаний на промежуточную прецизионность, представлены таблице 7.
Сравнения результатов количественного определения препарата в различные промежутки времени (разные дни) показывает, что между ними нет статистически достоверной разницы, т.е. результаты трех временных точек для каждой партии сопоставимы.
Аналитическая методика для количественного определения препарата травы клевера лугового выдерживает требования валидации по показателям «Прецизионность», характеризующую повторяемость (сходимость) и «Промежуточная прецизионность».
Аналитическая область методики – это интервал между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа (его количества, концентрации, активности и т.п.). В этом интервале получаемые с использованием валидируемой методики результаты должны иметь приемлемый уровень правильности и внутри лабораторной (промежуточной) прецизионности [3].
Таблица 7 - Результаты испытания на промежуточную прецизионность препарата (M+tm; p=0,05; n=5)
|
Трава клевера лугового |
Результаты измерения на 1 день |
Результаты измеренияна 2 день |
Результаты измерения на 3 день |
|
Партия 1 |
4,3305 (4,2842÷4,3564) |
4,2869 (4,2569÷4,3087) |
4,3199 (4,2931÷4,3499) |
|
Партия 2 |
4,3409 (4,3074÷4,3670) |
4,3253 (4,3152÷4,3422) |
4,3031 (4,2841÷4,3157) |
|
Партия 3 |
4,2807 (4,2600÷4,3138) |
4,2901 (4,2665÷4,3098) |
4,3121 (4,2881÷4,3306) |
К величине аналитической области методик для данного препарата предъявляются следующие требования: методика количественного определения должна быть применима в интервале от 80 до 120 % от номинального значения определяемой аналитической характеристики [3].
Аналитическая область методики может быть установлена по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели [3].
Линейность методики – это наличие линейной зависимости аналитического сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. При валидации методики ее линейность в аналитической области проверяют экспериментально измерением аналитических сигналов для не менее чем пяти проб с различными количествами или концентрациями определяемого вещества [3].
Для установления линейности в пределах аналитической области (80-120%), нами расчитан коэффициент корреляции (R), который должен быть R ≥ 0,99 [3].
В связи с предъявляемым и требованиями к величине аналитической области методик в интервале от 80 до 120% от номинального значения определяемой аналитической характеристики были получены следующие результаты (табл. 8, рис. 3-5).
Таблица 8 - Результаты изучения линейности препарата в аналитической области 80-120%(n=5)
|
№ |
% взятого образца препарата |
Партия 1 |
Партия 2 |
Партия 3 |
|
1. |
80% |
3,3579 |
3,5719 |
3,3911 |
|
2. |
90% |
3,8671 |
3,8699 |
3,9219 |
|
3. |
100% |
4,3305 |
4,3409 |
4,2807 |
|
4. |
110% |
4,8967 |
4,7079 |
4,8025 |
|
5. |
120% |
5,2311 |
5,3036 |
5,0965 |
|
Свободный член линейной зависимости (a) |
0,43934 |
0,05744 |
0,00714 |
|
|
Угловой коэффициент линейной зависимости (b) |
0,04776 |
0,043014 |
0,042914 |
|
|
Коэффициент корреляция (R) |
0,99757 |
0,99388 |
0,99603 |
|
|
Уравнение регрессии Y=aX+b |
Y=0,43934X+ 0,04776 |
Y=0,05744X+0,043014 |
Y=0,00714X+ 0,042914 |
|
27
Согласно требованиям ГФ 12, препарат - трава клевера лугового (партии 1,2,3), выдерживает линейность в аналитической области (от 80 до 120%).
Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией, нижний допустимостимый предел этой величины 0,99. Коэффициент корреляции рассчитывали с помощью программы Microsoft Excel.
Аналитическая методика для количественного определения пинитола в траве клевера лугового выдерживает требования валидации по показателям «Аналитическая область» и «Линейность».
Выводы. Методом ВЭЖХ установлено содержание пинитола в траве клевера лугового. Проведена валидация разработанной методики по параметрам: специфичность, правильность, повторяемость, прецизионность и линейность. Методика является аттестованной и может быть применена для контроля качества травы клевера лугового.