Резюме
Атомоксетин применяют для лечения синдрома дефицита внимания с гиперактивностью. Изучено распределение атомоксетина в органах и тканях крыс после внутрижелудочного введения дозы лекарственного вещества, соответствующей LD50 для исследуемых лабораторных животных. Количественное определение атомоксетина в экстрактах из биологического материала проводили УФ-спектрофотометрическим методом. Наибольшее содержание лекарственного вещества обнаружено в желудке, кишечнике, сердце и печени. Указанные выше органы могут быть рекомендованы в качестве объектов судебно-токсикологического исследования на присутствие атомоксетина.
Ключевые слова: атомоксетин, распределение в органах, УФ-спектрофотометрия.
Для профилактики отравлений лекарственными препаратами важное значение имеют результаты химико-токсикологического анализа, направленного на идентификацию лекарственного вещества, которое явилось причиной отравления. Согласно данным Европейского мониторингового Центра по наркотикам и наркомании (EMCDDA), из 7000 – 8000 летальных лекарственных отравлений, ежегодно регистрируемых в Европе в течение последнего десятилетия, более 85 % были диагностированы на основе результатов токсикологических исследований [1].
Атомоксетин, используемый для лечения синдрома дефицита внимания с гиперактивностью, а также в комплексной фармакотерапии депрессий различной этиологии [2], неоднократно упомянут в специальной литературе в связи с острыми и летальными интоксикациями в результате приема лекарственных средств [3–4]. Разработаны биоаналитические методы определения атомоксетина в плазме крови с помощью таких методов инструментального анализа как высокоэффективная жидкостная хроматография [3] и капиллярный электрофорез [5]. Систематические исследования по разработке методов определения атомоксетина в биологическом материале, пригодных для целей судебно-токсикологических исследований, не проводились.
Целью настоящего исследования явилось изучение распределения атомоксетина в органах и тканях лабораторных крыс после внутрижелудочного введения.
Материалы и методы. В эксперименте были использованы крысы массой 150 – 200 г, которые не получали пищу в течение суток. В желудок с помощью зонда вводили 320 мг/кг атомоксетина (в 2,5 мл дистиллированной воды), что соответствовало LD50 для указанных животных [6]. Через 30 мин животные принимали боковое положение и не меняли его до конца эксперимента. Прекращение сердцебиения крыс наблюдалось через 1,5 часа после начала эксперимента.
Для исследования брали сердце, печень, почки, селезенку, мозг, кишечник с содержимым, желудок с содержимым, кровь. Ткани органов гомогенизировали и обезвоживали путем растирания с тройным количеством безводного сульфата натрия. Полученную сыпучую массу переносили в стеклянную бюретку с закрепленной сверху делительной воронкой, в которую помещали 20 мл хлороформа. Атомоксетин элюировали из гомогенизированных тканей хлороформом. Полученный элюат очищали, взбалтывая с 15 мл воды, подщелоченной 25 % раствором аммония гидроксида до рН 8, водные фазы отбрасывали, а хлороформный элюат упаривали на водяной бане при температуре не выше 40ºС. Сухой остаток растворяли в 10 мл н-гексана, переносили в делительную воронку и проводили трехкратную экстракцию атомоксетина ацетонитрилом по 5 мл каждый раз. Ацетонитрил упаривали до удаления органического растворителя, сухой остаток растворяли в 10 мл хлороформа и проводили ТСХ-очистку полученного экстракта.
Методика изолирования атомоксетина из крови. К исследуемой крови прибавляли 5 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивали и смесь центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 3000 об/мин. Центрифугат сливали и экстрагировали биологические примеси 10 мл диэтилового эфира (по 5 мл дважды). Фазу органического растворителя отбрасывали, водную фазу подщелачивали 20 % раствором гидроксида натрия до рН 11 – 12, насыщали ее сульфатом аммония и дважды экстрагировали атомоксетин хлороформом по 5 мл каждый раз. Полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр с 0,5 г безводного сульфата натрия, упаривали до минимального объема (0,05 мл) и наносили полосой на линию старта хроматографической пластины для проведения ТСХ-очистки.
Методика ТСХ-очистки. Хлороформный экстракт помещали в фарфоровую чашку, выпаривали до минимального объема (0,05 мл) и наносили полосой на линию старта хроматографической пластины Merck. На расстоянии 2 см от указаной пробы наносили 10 мкл стандартного раствора атомоксетина в метаноле с концентрацией 2 мг/мл. Хроматограмму развивали в хлороформе, а затем, после высушивания на воздухе, в подвижной фазе этилацетат – метанол – 25% раствор гидроксида аммония (85:10:5). Полосу на хроматограмме, соответствующую стандартному раствору атомоксетина, проявляли реактивом Драгендорфа в модификации по Мунье, оставляя необработанной часть хроматограммы, соответствующей экстракту из биологического материала. С непроявленной полосы хроматограммы на уровне, который соответствовал пятну атомоксетина, препарат элюировали 4 мл метанола.
Количественное определение атомоксетина в элюатах проводили УФ-спектрофотометрическим методом. Для этого метанольный элюат выпаривали, сухой остаток растворяли в 5 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и исследовали УФ-спектр полученного раствора на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО) в диапазоне длин волн 225 – 320 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали растворы, полученные в холостых опытах с соответствующими органами животных. Концентрацию препарата в элюате (x, мкг/мл) рассчитывали по уравнению калибровочного графика: y = (0,00455 ± 4·10-5)x + (0,016 ± 0,005) (при λmax 270 нм) [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследования на животных проводились в соответствии с требованиями, которые регламентируются нормативными документами, и входят в комплекс доклинических исследований, необходимых для изучения безопасности лекарственных средств: приказы МЗ Украины № 944 от 14.12.2009 г., № 95 от 16.02.2009 г., № 460 от 23.07.2015 г., требования GLP, правила «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» (Страсбург, 1986 г.) [8].
Выделение атомоксентина из органов отравленных животных проводили элюированием препарата липофильным растворителем хлороформом из биологического материала, гомогенизированного и обезвоженного растиранием с безводным сульфатом натрия, с последующей экстракционной очисткой в системе неводных растворителей н-гексан – ацетонитрил. Данная методика разработана нами для изолирования липофильных лекарственных веществ [9]. Атомоксетинн является липофильным соединением, о чем свидетельствуют высокие значения коэффициента липофильности log P(octanol/water) = 4,23) и объема распределения Vd = 8,5 л/кг [3].
Методика изолирования атомоксетина из крови была оптимизирована на основании полученных нами экспериментальных данных о степени экстракции препарата из водных растворов в зависимости от природы органического растворителя, рН водной фазы и присутствия высаливателей [10].
Условия ТСХ-очистки были выбраны на основании ранее проведенных исследований по визуализации и установлению хроматографической подвижности атомоксетина в подвижных фазах, рекомендованных Международной ассоциацией судебных токсикологов (TIAFT) для общего ТСХ-скрининга [11]. Степень элюирования атомоксетина с хроматограмм метанолом составляла 99,4 %.
УФ-спектры исследуемых элюатов были аналогичными спектру стандартного раствора атомоксетина в 0,1 М соляной кислоте [10] и имели максимумы поглощения при длинах волн 270 ± 2 и 277 ± 2 нм. В УФ- спектрах холостых элюатов максимумов светопоглощения при указанных длинах волн не наблюдали. Уравнение калибровочного графика для количественного определения атомоксетина методом УФ- спектрофотометрии было получено с использованием серии стандартных растворов препарата в 0,1 М растворе соляной кислоты. Методика линейна в пределах концентраций атомоксетина 15,0 – 210 мкг/мл, значения LOD и LOQ составили соответственно 1,8 мкг/мл и 5,6 мкг/мл [7].
Результаты по определению содержания атомоксетина в органах и тканях, полученные УФ- спектрофотометрическим методом, с учетом эффективности использованных методик пробоподготовки, представлены в табл.
Таблица - Распределение атомоксетина в тканях и органах крыс
Масса крысы, г |
Введено атомоксети на, мг |
Объект исследования |
Масса объекта, г |
Найдено атомоксетина, мг |
|
во взятом объекте |
в пересчете на 100 г объекта |
||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
193 г |
61,8 |
сердце |
0,535 |
0,048 |
9,065 |
печень |
5,811 |
0,507 |
8,717 |
||
почки |
1,333 |
0,032 |
2,401 |
||
легкие |
1,306 |
0,061 |
4,634 |
||
селезенка |
0,911 |
0,028 |
3,073 |
||
мозг |
3,166 |
0,127 |
4,011 |
||
кишечник с содержимым |
12,676 |
4,772 |
37,646 |
||
желудок с содержимым |
2,779 |
9,124 |
328,320 |
||
кровь |
5,822 |
0,131 |
2,250 |
||
207 г |
66,3 |
сердце |
0,621 |
0,071 |
11,433 |
печень |
6,033 |
0,488 |
8,089 |
||
почки |
1,414 |
0,046 |
3,253 |
||
легкие |
1,368 |
0,077 |
5,629 |
||
селезенка |
0,962 |
0,035 |
3,638 |
||
мозг |
3,188 |
0,143 |
4,486 |
||
кишечник с содержимым |
14,263 |
5,618 |
39,389 |
||
желудок с содержимым |
2,915 |
8,676 |
297,633 |
||
кровь |
6,416 |
0,153 |
2,385 |
||
187 |
59,9 |
сердце |
0,511 |
0,080 |
15,656 |
печень |
5,436 |
0,412 |
7,579 |
||
почки |
1,273 |
0,030 |
2,357 |
||
легкие |
1,204 |
0,086 |
7,143 |
||
селезенка |
0,861 |
0,029 |
3,368 |
||
мозг |
2,952 |
0,161 |
5,454 |
||
кишечник с содержимым |
13,127 |
4,084 |
31,111 |
||
желудок с содержимым |
2,813 |
8,336 |
296,338 |
||
кровь |
5,537 |
0,124 |
2,239 |
Выводы. В результате проведенных исследований установлено, что после внутрижелудочного введения среднелетальной дозы атомоксетина в организм крысы наибольшее содержание лекарственного вещества обнаружено в желудке, кишечнике, сердце и печени. Указанные выше органы могут быть рекомендо-ваны в качестве объектов судебно-токсикологического исследования на присутствие атомоксетина.
Литература
- European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction. Technical report: An analysis of post-mortem toxicology practices in drug-related death cases in Europe. – Luxembourg : Publications Office of the European Union, 2019. – 52 p.
- Treuer, T. A systematic review of combination therapy with stimulants and atomoxetine for attention- deficit/hyperactivity disorder, including patient characteristics, treatment strategies, effectiveness, and tolerability / T. Treuer, S. S. Gau, L. Méndez, W. Montgomery, J. A. Monk, M. Altin, H. J. Dueñas // J. Child Adolesc. Psychopharmacol. – 2013. – Vol. 23, Issue 3. – P. 179193.
- Clarke's analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material: 4-th edition / Ed. by A. C. Moffat, M. D. Osselton, B. Widdop. – London, Chicago: Pharmaceutical Press, 2011. – 2736 p.
- Garside, D. Postmortem tissue distribution of atomoxetine following fatal and nonfatal doses – three case reports / D. Garside, J. D. Ropero-Miller, E. C. Riemer // J. Forensic Sci. – 2006. – Vol. 51 (1). – P. 179–182.
- Capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence for determination of atomoxetine hydrochloride and the study on its interactions with three proteins / H. J. Zeng, R. Yang, Y. Zhang et al. // Luminescence. - 2015.- Vol. 30, Issue 2.- P. 124-130.
- Strattera capsule: material safety data sheet : Version 1.5 : [Electronic resource] – Lilly, 2010. – 8 p. – Available at : Shttps://s3-us-west-2.amazonaws.com/drugbank/msds/DB00289.pdf?1552515589 (date of the application : (04.09.2019).
- Томаровська, Л. Ю. Розробка УФ-спектрофотометричного та екстракційно-спектрофотометричного методів кількісного визначення атомоксетину, придатних для хіміко-токсикологічного аналізу / Л. Ю. Томаровська, С. В. Баюрка, С. А. Карпушина // Вісник фармації. – 2017. – № 4 (92). – С. 15 – 19.
- Директива Совета ЕС о сближении законов, постановлений и администрирование положений государств ЕС по вопросам защиты животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (86/609/ЕЕС) // В кн.: Надлежащая производственная практика лекарственных средств // Под ред. Н.А. Ляпунова, В.А. Загория, В.П. Георгиевского, Е.П. Безуглой. – Киев:"Морион", 1999. – С. 508-545.
- Пат. на корисну модель 95171 Україна, мпк7 G01N 33/15 (2006.01). Cпосіб виділення амітриптиліну та інших ліпофільних речовин з біологічного матеріалу / Баюрка С. В., Петюнін Г. П., Карпушина С. А. ; власник Національний фармацевтичний університет. – № u 2014 07572 ; заявл. 07.07.2014 ; опубл. 10.12.2014, Бюл. №23. – 3 с.
- Томаровская, Л. Ю., Разработка биоаналитической методики определения атомоксетина методом ВЭЖХ / Л.Ю. Томаровська, С.В. Баюрка, С.А. Карпушина //Фармация Казахстана.–2019. –Т. 211,№ 2.- С.17-20.
- Томаровська, Л.Ю.Розробка методів ідентифікації атомоксетину, придатних для хіміко-токсикологічного аналізу // Л. Ю. Томаровська, С. В. Баюрка, С. А. Карпушина // Вісник фармації. – 2017. – № 2 (90). – С. 13 – 20.