Классификация молочнокислых бактерий из растительного сырья южного региона Казахстана

Аннотация

Лактобациллы широко распространены во многих природных средах, которые играют важную роль в процессе вскрытия. Некоторые из этих видов относятся к группе молочнокислых бактерий, обогащает ферментированных продуктов полезными свойствами. Один из видов лактобацилл L. plantarum полезен для здоровья, но его идентификация является одной из главных проблем. Новизна исследовательской работы была классифицирована методами классификации молочнокислых бактерий, выделенных из растительного сырья с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), изучения их свойств, а также анализа нуклеотидной последовательности современного молекулярного гена 16S rRNA. Применение в производстве с указанием важных, полезных моментов выявленного штамма. Цель исследования: извлечение и классификация лактобактерий, выделенных из сортов огурца (Cucumis sativus L.) и клевера (Trupolium repens), выращиваемых в южном регионе Казахстана. Современным методом, используемым при классификации молочнокислых бактерий, является полимеразная цепная реакция. Проводится с изучением генотипических и фенотипических характеристик штаммов. Методика выполняется по специальным ступеням.

Введение

Молочнокислые бактерии имеют практическое значение. Антагонистические свойства молочнокислых бактерий начали применять с древнейших времен: продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий считались одним из первых антисептиков народной медицины на основе бактерий. Штаммы молочнокислых бактерий широко используются в качестве пробиотиков для человека и животных. Молочнокислые бактерии широко распространены в природе и имеют важное значение в ферментационных процессах. Среди лактобактерий Lactobacillus plantarum является одним из основных видов, который обладает огромной пользой для здоровья, в том числе выполняет функции улучшения функции желудочно- кишечного тракта, иммунной модуляции и снижения уровня холестерина [1]. L. Plantarum- гомоферментативная лактобактерия, встречается в основном в ферментированных или консервированных пищевых продуктах. L. plantarum завершает заключительную стадию ферментации, имеет более высокую кислотостойкость при естественной ферментации или консервировании фруктов и овощей чем другие бактерии [2]. Идентификация лактобактерий является одной из значимых проблем прикладной микробиологии. Для идентификации клеток лактобактерий используются Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp., CKC, ДНК зонды и ПЦР-праймеры. Ген TUF, гены рРНК 16S и 23 s получены из последовательности гена гесА в качестве праймеров и зондов. Методы ПЦР используются одновременно для количественной идентификации клеток лактобактерии в культуре или в образцах ферментированной пищи. Ростовая и ферментативная активность L. plantarum оказывает существенное влияние на конечный продукт в огурцах и капусте, т. е. на качество ферментации [3].

Материалы исследования: сорта огурца (Cucumis sativus L.) и клевера ползучего (Trupolium repens), выращиваемые в южной части Казахстана. Для выделения лактобактерий из огурцов и клевера, растения помещают в соляный раствор (7-9% NaCl).

Методы исследования

• Окраска по Граму: все исследуемые штаммы являются грамположительными микроорганизмами;
• Исследуемые штаммы бактерии растут в питательной среде при pH 9,2-9,6; оптимальная температура 35-37°С;
• В питательных средах, содержащих 2, 4, 6% поваренной соли, рост наблюдался в штаммах, выделенных из клевера; все исследуемые штаммы могут расти в среде с предельным содержанием соли 40% ;
• Сквашивание молока исследуемыми штаммами микроорганизмов происходит 6-9 часов и предел кислотного образования колеблется от 90-127°Т;
• Штаммы микроорганизмов способены образовывать аммиак;
• В качестве источника углерода штаммы применяют глюкозу, лактозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу. Рост лактобактерий при различных водородных показателях и температурных условиях различен. Рост лактобактерий при различных водородных показателях и температурных условиях различен. Показатели указанные в 1 таблице.

Таблица 1 Вероятность роста лактобактерий

Для изучения движений были разработаны препараты, содержащие живые клетки. Все исследования проводились традиционными методами: капельным методом, с использованием светового микроскопа.

Результаты исследования морфологических свойств отобранных штаммов бактерий представлены в 2 таблице.

Согласно данным таблице штаммы бактерий штаммы порядковый номер №1-5 грамположительные, шаровидные неподвижные микроорганизмы, неспособные к спорообразованию. Штаммам №6-8 характерна палочковидная форма, штаммы грамположительные, неподвижные и не образующие спор.

Таблица 2 Морфологические свойства полученных штаммов лактобактерий

Результаты исследования

После морфологических, культуральных, физиолого-биохимических исследований проводится анализ 16S PHK для идентификации штаммов микроорганизмов. 16S рРНК является одним из трех основных типов рРНК и является основым рибосомы прокариот. Числа в названии PHK равны значению константы седиментации. На первом этапе был проведен сев каждой исследуемой культуры и получена биомасса для проведения анализа PHK 16S. Далее были выделены молекулы ДНК. Выделение ДНК из многих видов растений считается чрезвычайно сложным из-за концентрации вторичных метаболитов, таких как полисахариды и полифенолы, а также белков, жиров и ингибиторов в образце.

Получены консервативные праймеры и режимы для обработки кодируемых генов 16s PHK - 8f (AGAGTTGATCTGCTCAG) и 1492г (Gcytaccttgtgtacgactt) 926г - Ccgtcaattcctttagttt. в целом режим амплификации метода ПЦР состоял из 35 циклов. Требования к амплификации методом ПЦР: в первом случае денатурация ДНК 95°С - 5 минут, во втором случае денатурация ДНК 95°С - 30 сек. температура нагрева рекомендуемых праймеров составляет 45°С - 55°С 1 минута и стадия элонгации температура 72°С 45 сек., последняя стадия синтеза проводилась в пределах 72°С - 5 мин. При визуализации ПЦР-продукта электрофорез проводился в 1% агарозном геле несколько минут.

Объем реакционных смесей составил 25 мкл. Смесь содержит: 2,5 мкл 10 X буфер; 1,5 мкл 25 мМ MgC12; 4 мкл 0,2 мМ конценрационный dNTP; 0,5 мкл Taq polymerase фермент; 1,0 мкл 25 мкМ праймер; 3 мкл ДНК и дистиллированная вода 12,5 мкл.

В нашем исследовании генетическая идентификация 8 штаммов осуществлялась методом определения прямой нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16s rRNA, в последующем осуществлено сравнение нуклеотидной идентичности с последовательностями, переданными на хранение в международной базе данных Gene Bank. В результате выделения ДНК были получены образцы с высокой концентрацией ДНК от 80 до 150 нг/мкл, длина волн составила 260/280 в среднем 1,99. Методом ПЦР амплифицирована фрагмент гена 16S rRNA с молекулярной массой около 800 п.н.

Генетическое родство исследованных штаммов гена 16S тКХАсоставляет 98% относительно Lactobacillus plantarum. Определили лимит ПТ(Р праймеров согласно описанным действиям. В соответствии с описанными условиями молекулярная масса 4-го образца (техника поверхностного посева, при 25 °C) равна 598 Ьр, эти штаммы получены в результате ПЦР. Для быстрой идентификации и определения видов бактерий PHK анализирует последовательность 16S, 23 S и 16S-23S генов ITS, производит родственные и турспецифические олигонуклеотидные праймеры и зонды [4]. Однако сложно определить Lactobacillus plantarum, так как генотип, фенотип, последовательность цепей L. pentosus являются похожими на L. paraplantarum. В этой связи, использование цепи ITS L. plantarum праймер LPL- 1/LPL-2, относящийся к двум штаммам L. pentosus, определяет, что ложный положительный результат не показывает. Особенность этих ПЦР праймеров праймеры L. plantarum были похожи на праймер готового гена гесА. Это праймеры гена гесА может отличить штамма L. paraplantarum от штаммов L. pentosus и L. plantarum.

L. plantarum гомоферментативные и аргинин негативные, мезофильные бактерии. Формы колоний, которые произрастали из общих моделей, агара MRS, белые и неправильные формы, а также центры некоторых из них были приподняты. Согласно результатам работы L. plantarum является толерантным к NaCl, чем другие штаммы, и они могут расти на 8% NaCl [5].

Заключение

При использовании 16 и LPL видеоспецифических праймеров при обработке фрагмента размером 265 п.н установлено, что исследуемый штамм относится к виду Lactobacillus plantarum. Отсутствие фрагментов при использовании праймеров 16 и Lpapl, 16 и Lpe показывает, что исследуемый штамм не относится к видам Lactobacillus paraplantarum и Lactobacillus pentosus. По результатам проведенного анализа Секвенс вариабельных участков генов, кодирующих PHK 16s, доказано, что Lactobacillus plantarum (99%) относится к виду. Изучены морфологическими, культурными, физиолого-биохимическими методами и их результаты представлены в таблице. Идеификацию исследуемых штаммов бактерий осуществлял методом ПЦР. Анализ ПЦР показал, что праймер Lpl характерен для типа Lactobacillus plantarum. Методом ПТТР классифицированы молочнокислые бактерии из растительного сырья. Вырабатывая молочнокислые бактерии из различных источников сырья, можно получить микроорганизмы, необходимые для производства, путем изучения новых штаммов.

Литература

1. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной микробиологии: Для высш. с.-х. учеб.заведений по агр. спец. / под ред. Г.И. Ежова; изд. 2-е, перераб. и доп. - M.: Высш. - M.: Высшая школа, 2011.
2. Гриневич, А.Г. Молочнокислые бактерии. Селекция промышленных штаммов. - M.: Высшая школа, 2006. - 400 с.
3. Цугкиев Б.Г. Синбиотические кисломолочные продукты функционального назначения / Цугкиев Б.Г., Кабисов Р.Г., Рамонова Э.В. // Известия Горского государственного аграрного университета. - 2016. - Т.53. -4.1. - 102-108 бет.
4. Точилина, А.Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus: автореф. дне. ... канд. биол. наук: 03.00.04, 03.00.07 / А.Г.Точилина; Нижегор. НИИ эпидемн. и микробиол. - Нижний Новгород, 2012. - 263с
5. Горбачева, Е.С. Современные тенденции отбора и идентификации производственно-ценных штаммов, сбраживающих лактозу / Е.С. Горбачева // СевКавГТУ. Серия «Продовольствие», 2006. №2. - С. 24.