Влияние криоконсервации на выживаемость семян Chamomilla reticuta сорта «Подмосковная» и химический состав эфирного масла

В статье изучено влияние сверхкритических низких температур на количественный и качественный состав эфирного масла ромашки аптечной сорта «Подмосковная». Семена изучаемого вида растения перед посадкой в открытый грунт обрабатывали сверхнизкой температурой (–196 ºС) и определяли жизнеспособность семян в лабораторных условиях. Криообработку проводили путем прямого погружения семян в пластиковых пробирках в сосуды Дюара с жидким азотом. Криопротекторы не применялись. Длительность криообработки составляла 1 ч, 3 ч и представляла ступенчатую заморозку. Отработка ступенчатой заморозки семян проводилась в следующей последовательности: 1 ч в холодильной камере (+4 ºС), 1 ч в морозильной камере (–18 ºС) и 1 ч в жидком азоте. Во всех случаях эксперимента применяли медленный режим оттаивания. После криогенного воздействия семенной материал высаживался в открытый грунт. Извлечение эфирного масла проводили методом гидродистилляции на аппарате Клевенджера. Определение компонентного состава эфирных масел проводили на газовом хроматографе Clarus-SQ 8 с масс-спектрометрическим детектором. В результате исследования установлено, что действие сверхнизких температур на семенной материал ромашки сорта «Подмосковная» не повлияло отрицательно на количественный и качественный состав эфирного масла ромашки аптечной. Наоборот, данный метод обработки семян положительно сказался на количественном составе эфирного масла в процессе роста растения, и в некоторых случаях повысил процентное содержание некоторых компонентов, таких как α-фарнезен, β-фарнезен, спатуленол, цис-ен-ин- дициклоэфир.

Введение

Ромашка аптечная (Chamomilla recutita (L.) Raushert., или Matricaria chamomilla L.) — однолетнее травянистое растение семейства Астровые (Asteraceae), типовой вид рода Ромашка (Matricaria L.). Данное лекарственное растение входит в фармакопеи более чем двадцати стран мира [1]. Цветки ромашки аптечной издавна применяются в медицинской практике в качестве противовоспалительного, антисептического и обезболивающего средства: при ангинах, тонзиллитах и других воспалительных процессах; ранозаживляющего средства — в стоматологии, гинекологии; желчегонного, противомикробного, успокаивающего, гипосенсибилизирующего, противовирусного, противотокси- ческого средства при заболеваниях желудка, кишечника, печени, при повышенном газообразовании; действует возбуждающе на центральную нервную систему, усиливает и учащает дыхание, расширяет сосуды головного мозга. В народной медицине ромашка используется для лечения различных аллергических реакций в качестве примочек. Ромашковое масло используется в ароматерапии [2]. Это ценнейшее лекарственное растение, сырьем служат соцветия, содержащие эфирное масло, в состав которого входит более 40 компонентов. Основные лечебные свойства приписывают хамазулену, содержание его в селекционных сортах может достигать 10 % и более. В цветках ромашки лекарственной найдены флавоноиды, производные апигенина, лютеолина и кверцетина, обладающие противовоспалительным действием, а также β -каротин, кумарины, гликозиды спазмолитического действия, гликозиды потогонного действия, полисахариды и органические кислоты [3, 4].

Г.Г. Первышиной и другими были изучены качественный и количественный состав веществ ромашки аптечной и ромашки душистой, культивируемой в Российской Федерации. С помощью УФ-спектроскопии авторами было установлено, что в водных экстрактах ромашки аптечной содержатся фенольные соединения, представленные фенолкарбоновыми кислотами, таннинами, флавоноидами, кумаринами, а также цис- и транс-бициклоэфирами, относящимися к полииновым соединениям, бисаболол [5].

Ранее были проведены газохроматографические исследования состава летучих органических соединений ромашки аптечной. При этом были идентифицированы альдегиды — всего 38,76 % (2-метилпропаналь, 3-метилбутаналь, 2-метилбутаналь, пентаналь, гексаналь, бензальдегид, 3-фенилпропаналь); вторыми по содержанию — 16,26 % — были выделены сесквитерпены и их производные (β-фарнезен, аромадендрен, бисаболол оксид Б, 7-метоксикумарин, бисаболол оксид А); эфиры — 14,65 %; спирты — всего 3,7 % (гепта-4,6-диин-2-ол, 1-пентен-3-ол, 2-метилбутан-1-ол, 3-метилбутан-1-ол, 1-пентанол, 2,3-бутандиол); монотерпены и их производные — 2,97 % (α-пинен, п-цимен, лимонен, эвкалиптол). По дальнейшим работам автора видно, что основными составляющими веществами явились: 3-метилбутаналь, 2-метилбутаналь, этил-2-метилбутаноат, β-фарнезен, α-бисаболол оксид Б, α-бисаболол, бисаболоксид А, хамазулен, ен-ин-дициклоэфир [6]. Основными поставщиками сырья ромашки на мировой рынок являются Аргентина, Болгария, Германия, Египет, Словакия, Чехия. На основе цветков ромашки готовят такие лекарственные препараты, как «Ромазу- лан», «Алором», «Арфазетин», «Ротокан», «Камилозид» [3, 7, 8].

Одним из наиболее приоритетных направлений в селекции лекарственных культур является сохранение и поддержание генофонда сортов и улучшенных популяций, созданных селекционерами на протяжении более 50 лет. В связи с тем, что не всегда есть возможность поддержания коллекции сортов лекарственных культур, осуществляется долговременное сохранение этой уникальной коллекции в виде семян. Семена являются наиболее оптимальной формой хранения генетического материала, так как образцы требуют сравнительно небольшого ухода, остаются жизнеспособными в течение длительного периода времени [9]. С этой целью в начале 70-х г. в ряде стран (Италия, Германия, США, Япония) были организованы первые центры по долговременному сохранению зародышевой плазмы. Так как продолжительность жизни семян очень разная: от нескольких часов (у некоторых тропических орхидных) до десятков и сотен лет, то одним из самых важных вопросов является режим их хранения, который зависит от видовой принадлежности, анатомических, физиологических, биохимических, морфологических особенностей семян, условий их содержания (температура, влажность, состав газовой среды и др.) [10].

Одной из основных проблем, с которой сталкиваются производители сырья лекарственных растений, остается отсутствие современных экономически эффективных технологий выращивания, а также хранения семенного материала. Около 100000 видов растений находятся под угрозой исчезновения. Стратегия сохранения биологического разнообразия на Земле сегодня включает два основных направления: сохранение in situ (в естественных биоценозах) и сохранение разнообразия ex situ: в зоопарках, заповедниках, полевых коллекциях, ботанических садах, создание генбанков животных, растений, микроорганизмов и т.д. Более 300 тысяч образцов семян хранятся в национальных, региональных и международных генбанках. В настоящее время основным способом сохранения генофонда растительных ресурсов мира ex situ является длительное низкотемпературное хранение семян [11].

Известно, что общепринятые режимы хранения семян при низкой положительной температуре не обеспечивают длительного хранения семян; наиболее важным, экологически чистым и сравнительно недорогим способом считается хранение семян в жидком азоте при минус 196°С (криоконсервация) [12]. В последние годы с развитием современных биотехнологических методов появляются новые технологии криосохранения семенного материала растений, что позволяет создавать генные банки длительного хранения. Осуществлять их активное размножение в необходимых объемах. На территории Казахстана криосохранение, как метод сохранения семенного материала лекарственных растений, практически не используется. Имеются отдельные работы по криоконсервации семян и апикальных меристем плодовых растений [13–15].

Возникает ряд вопросов при использовании метода криосохранения, например, какое оказывает действие сверхнизкая температура в последующем на рост и развитие растения, на качественный состав эфирного масла, на целебные свойства лекарственных культур и т.д.

В связи с этим целью нашего исследования явилось изучение влияние криозамораживания на семенной материал ромашки аптечной сорта «Подмосковная» на химический состав эфирного масла.

Объекты и методика исследований

Объектом исследования являлась ромашка аптечная сорта «Подмосковная». Для изучения изменения количественного и компонентного состава эфирного масла ромашки аптечной семена данного вида растения перед посадкой в открытый грунт предварительно обрабатывали сверхнизкой температурой (–196 ºС) и определяли ее жизнеспособность. Всхожесть рассчитывали как отношение числа проросших семян к числу первоначально заложенных на проращивание и выражали в процентах. После оттаивания все семена ставили на проращивание в чашках Петри по 50 шт. в 4-кратной повторности на двухслойной фильтровальной бумаге, предварительно смоченной дистиллированной водой [16]. Чашки Петри с семенным материалом помещали в климатическую камеру (Binder) при температуре +25 ºС с постоянным освещением. Криообработку проводили путем прямого погружения семян в пластиковых пробирках в сосуды Дюара с жидким азотом [17]. Криопротекторы не применялись. Время криохранения для определения лабораторной всхожести составляло от 24 ч до 7 суток. В случае с заморозкой длительностью 24 ч образцы семян размораживали при комнатной температуре в течение 2 ч, а во втором случае (7 сут) была проведена быстрая и медленная разморозка. Быструю разморозку осуществляли в водяной бане при температуре +60 ºС в течение 1 мин, медленную — при комнатной температуре в течение 3–4 ч. Длительность криообработки семян перед посадкой в открытый грунт составляла 1 ч, 3 ч и представляла собой ступенчатую заморозку. Отработка ступенчатой заморозки семян проводилась в следующей последовательности: 1 ч в холодильной камере (+11 ºС), 1 ч в морозильной камере (–10 ºС) и 1 ч в жидком азоте. Во всех случаях разморозку проводили медленно. После криообработки семена были высажены в открытый грунт в поселке Ботакара в первой половине дня, в качестве органического удобрения в почву был внесен навозный перегной. Надземную часть растения собирали в фазу цветения. Сушка проводилась воздушно-тканевым способом в тени.

Извлечение эфирного масла проводили методом гидродистилляции на аппарате Клевенджера [18]. Определение компонентного состава эфирных масел осуществляли на газовом хроматографе Clarus-SQ 8 с масс-спектрометрическим детектором. Хроматографические условия: колонка капиллярная RestekRxi®-1 ms 0,25 мм×30 м×0,25 мкм; объем пробы: 1,0 мкл; газ-носитель Не; скорость газа-носителя: 1 мл/мин; деление потока 1:25; t колонки: 45 ºС (2 мин), подъем 1,5 ºС/мин до 200 ºС, далее 15 ºС/мин до 280 ºС, изотермический режим при 280 ^оС в течение 10 мин; t испарителя — 280 ºС, масс-спектрометрический детектор: t — 240 ºС, EI+ = 70 eB; время сканирования с 4 по 120 мин; режим сканирования ионов 39–500 m/z. Процентное содержание компонентов вычисляли автоматически, исходя из площадей пиков общей хроматограммы ионов (рис. 1). Компоненты идентифицировали по масс-спектрам и временам удерживания, с использованием библиотеки NIST. Время удерживания компонентов пересчитывали относительно предельных углеводородов.

Результаты и обсуждение

После криообработки семян в жидком азоте длительностью 24 ч семена ромашки аптечной сорта «Подмосковная» были высажены в чашках Петри для определения лабораторной всхожести и энергии прорастания. Результаты проведенного эксперимента показаны в таблице 1.

Таблица 1 Показатели всхожести и энергии прорастания семян Chamomilla recutita при криообработке длительностью 24 ч

В результате проведенного исследования были получены следующие показатели. Контрольная группа семян ромашки аптечной сорта «Подмосковная» показала невысокую всхожесть и составила 52,5 %. Криообработка повысила всхожесть семян на 21 % (73,5 %), кроме того, на 21,5 % повысилась и энергия прорастания (рис. 2). Невысокая всхожесть семян контрольной группы, видимо, связана с длительным сроком хранения, более 1 года. Согласно литературным данным, максимальная всхожесть отмечена для семян ромашки аптечной сроком хранения от 6 до 12 месяцев, после чего наблюдается постепенное снижение всхожести [19]. Ряд авторов [4] установили важные факты, вскрывающие некоторые причины низкой всхожести семян у растений по их хранению: снижение интенсивности дыхания; увеличение содержания свободных жирных кислот; уменьшение содержания жизненно необходимых веществ; снижение содержания сахарозы; действие патогенной микрофлоры.

По сравнению с первой частью эксперимента мы провели более длительную криообработку в течение 7 суток. Также были проведены работы по изучению влияния видов оттаивания после заморозки на всхожесть семян. После глубокого замораживания провели быструю и медленную разморозки (табл. 2).

Таблица 2 Показатели всхожести и энергии прорастания семян Chamomilla recutita

при криообработке длительностью 7 сут

Серия «Биология. Медицина. География». № 3(99)/2020

103

Результаты проведенного исследования показали, что всхожесть семян ромашки аптечной сорта «Подмосковная» после криогенного хранения выше контрольных значений, как при быстром (71 %), так и при медленном оттаивании (78 %). Энергия прорастания на 10 % повысилась при медленном оттаивании, а при быстром оттаивании показатели были на уровне контроля (рис. 3).

Полученные результаты показывают, что криозамораживание семян в жидком азоте (–196 ºС) не оказало отрицательного действия на жизнеспособность семян ромашки аптечной, особенно при длительной заморозке (7 сут) с медленным оттаиванием. После криогенного воздействия всхожесть семян повышалась либо оставалась на уровне контроля.

Следующим этапом являлось определение количественного и качественного состава эфирного масла ромашки аптечной сорта «Подмосковная», выращенной из семян после замораживания в жидком азоте при температуре –196 ºС. Экспозиция — 1, 3 ч и ступенчатая заморозка.

Эфирное масло ромашки аптечной представляет собой очень вязкую жидкость, цвета от темносинего до голубовато-зеленого, обладающую характерным запахом: бальзамическим, медовым, отчасти цветочным, напоминающим яблочный. По этой причине масло находит применение в парфюмерии, в частности, используется для придания шипровых нот. Синяя окраска объясняется присутствием хамазулена, который сам по себе не является компонентом ромашки, но образуется из матрици- на в процессе отгонки с водяным паром [20].

Извлечение эфирного масла ромашки аптечной сорта «Подмосковная» проводили методом гидродистилляции после чего был изучен и сопоставлен его количественный состав (табл. 3).

Таблица 3 Количественный состав эфирных масел Chamomilla recutita сорта «Подмосковная» после криообработки

Данные таблицы показывают, что количественное содержание эфирных масел в указанных выше образцах различно. Так, в образце со ступенчатой заморозкой, содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах в перерасчете на абсолютное сухое сырье составило 0,26 %, что значительно превышает значение контроля. В образце с длительностью криообработки в 3 ч количество эфирного масла составило 0,18 %, что также выше показателя контрольной группы. По-видимому, данное различие в количественном составе связано с изменениями внутриклеточных биохимических процессов в семенах под воздействием сверхнизких температур, что включило механизм, который привел к повышению количественного содержания эфирных масел при произрастании.

104

Вестник Карагандинского университета

Методом газовой хроматографии в каждом из исследуемых образцах ромашки аптечной были определены около 45 компонентов эфирного масла. Основными компонентами являются органические соединения сесквитерпеновой группы (табл. 4).

Таблица 4 Компонентный состав эфирных масел Chamomilla recutita сорта «Подмосковная» после криообработки

В ходе исследования было выявлено, что в контрольной группе ромашки аптечной преобладающими компонентами являются α-бисабололоксид Б — 15,7 %, α-фарнезен — 13,8, цис-ен-ин- дициклоэфир — 9,0, спатуленол — 8,3, гермакрен Д — 3,5 %. Наименьшие процентные показатели у хамазулена — 3,0 % и α-бисабололоксида А — 2,6 %. Данный качественный состав эфирного масла ромашки аптечной сорта «Подмосковная» также подтверждается в работе В.В. Пунегова, где указывается, что сорт «Подмосковная» отличается высоким содержанием α-бисабололоксида Б и практическим отсутствием α-бисаболола [21].

В образце ромашки аптечной, семенной материал которой предварительно был обработан сверхнизкой температурой длительностью 1 ч, преобладающими компонентами являются α-фарне- зен — 25,2 %, спатуленол — 12,3, цис-ен-ин-дициклоэфир — 7,3, гермакрен Д — 5,9 и бициклогермакрен — 5,0 %. В данном образце очень низкое процентное содержание хамазулена — 0,5 %.

В образце с криообработкой длительностью 3 ч основными соединениями являются спатуле- нол — 15,3 %, α-фарнезен — 8,1 % и цис-ен-ин-дициклоэфир — 7,1 %. Необходимо отметить, что отличительной особенностью данного образца является полное отсутствие таких компонентов, как хамазулен, α-бисабололоксид Б и α-бисабололоксид А.

В варианте со ступенчатой заморозкой преобладают такие компоненты, как спатуленол — 16,3 %, цис-ен-ин-дициклоэфир — 11,8, β-фарнезен — 9,9, фарнезен — 6,3, бициклогермакрен — 2,5 %.

Стоит отметить, что компонентный состав эфирного масла ромашки аптечной, семена которой подвергались сверхкритической низкой температуре, отличается от контроля повышенным содержанием таких компонентов, как α-фарнезен, β-фарнезен, которые обладают противовоспалительными, успокаивающими и противогрибковыми действиями [22], спатуленол, цис-ен-ин-дициклоэфир, обладающие фунгицидными, антиаллергенными и ранозаживляющими действиями [2].

Заключение

Таким образом, по полученным нами данным, можно сделать вывод, что действие сверхнизких температур на семенной материал ромашки аптечной не повлияло отрицательно на жизнеспособность семян, на количественный и качественный состав эфирного масла. Наоборот, данный метод хранения семян положительно сказался на количественном составе эфирного масла в процессе роста растения, и в некоторых случаях даже повысил процентное содержание некоторых компонентов эфирного масла. Также повысилась энергия прорастания и всхожесть семян. В связи с этим криоконсервация, как метод хранения семян и поддержания коллекции сортов лекарственных культур, может смело применяться без риска потери ценных целебных свойств растения.

Исследования выполнены в рамках внутреннего грантового проекта Карагандинского университета им. акад. Е.А. Букетова «Сбор и подготовка образцов семян лекарственных растений, закладка опытов по криоопределению условий замораживания».

Список литературы

1. Загорулько Е .Ю. Подходы к стандартизации цветков ромашки аптечной (Chamomillae recutita flores) в Российской и зарубежных фармакопеях / Е.Ю. Загорулько, М.Г. Ожигова // Фармация и фармакология. — 2017. — Т. 5, № 2. — С. 135– 149. — URL: https://doi.org/10.19163/2307–9266–2017–5–2–135–149.
2. Жураева А.А. Изучение компонентного состава эфирного масла цветков ромашки аптечной, произрастающей в Узбекистане / А.А. Жураева, В.Н. Абдуллабекова, К.Ш. Мухитдинова, Д.Т. Гаибназарова // Вестн. фармации. — 2018. — № 2(80). — С . 13–17.
3. Тоцкая С. А. Ромашка аптечная (Chamomilla recutita (L.) Raushert.) — объект селекции / С. А. Тоцкая, М. Ю. Грязнов // Биологические особенности лекарственных и ароматических растений и их роль в медицине: сб. науч. тр. Междунар. науч.- практ. конф., посвящ. 85-летию ВИЛАР. — М., 2016. — С. 321–324.
4. Губанов И. А. Лекарственные растения / И.А. Губанов. — М .: Московские университеты, 1993. — С. 8.
5. Первышина Г. Г. К вопросу о содержании биологически активных веществ ромашки аптечной (Chamomilla recutita) и ромашки душистой (Chamomilla suaveolens), произрастающих в Красноярском крае / Г.Г. Первышина // Химия растительного сырья. — 2002. — № 3. — С. 21–24.
6. Павлова Л. В. Газохроматографический анализ ромашки аптечной (Chamomilla recutita R.) / Л.В. Павлова // Аналитика и контроль. — 2013. — Т. 17, № 1. — С. 66–75.
7. Фитопрепараты ВИЛАР: науч.-справоч. изд. — М.: Борус-пресс, 2009. — 256 с.
8. Регистр лекарственных средств России. — М.: Веданта, 2015. — 351 с.
9. Свистунова Н.Ю. Изучение влияния продолжительности и режима хранения сортовых семян лекарственных растений на основные посевные качества и цитогенетические характеристики их проростков / Н.Ю. Свистунова // Роль ботанических садов и дендрариев в сохранении, изучении и устойчивом использовании разнообразия растительного мира: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 85-летию Центр. бот. сада НАН Беларуси. — Минск, 2017. — С. 528.
10. Бутенко О.Ю. Влияние режимов замораживания и оттаивания на всхожесть семян сосны и ели / О.Ю. Бутенко,А.С. Бондаренко, Н.Н. Пелевина // Тр. СПб. науч.-исслед. ин-та лесного хозяйства. — 2014. — № 1. — С. 38–46.
11. Тихонова Н.Г. Стратегия и методы длительного хранения генофонда растений / Н.Г. Тихонова, Г.И. Филипенко,В.Г. Вержук, А.С. Жестков // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 2. — С. 76–84.
12. Николаева М.Г. Долговременное хранение семян дикорастущих видов растений. Биологические свойства семян / М.Г. Николаева, В.Л. Тихонова, Т.В. Далецкая // Консервация генетических ресурсов. Информационный материал. — Пущино: Пущин. науч. центр РАН, 1992. — 36 с.
13. Ishmuratova M.Yu. Cryopreservation of Calendula officinalis seeds / M.Yu. Ishmuratova, S.U. Tleukenova, S.N. Atikeyeva, A.K. Auelbekova, G.O. Zhuzbayeva, Zh.Zh. Zhumagaliyeva // EurAsian Journal of BioSciences. — 2020. — Vol. 14, Iss. 1. — P. 501–505. — URL: http://www.ejobios.org/article/cryopreservation-of-calendula-officinalis-seeds-7521.
14. Павлов А.В. Криоконсервация как метод сохранения отдельных видов плодово-ягодных культур и дикорастущих лекарственных растений / А.В. Павлов, В.Г. Вержук, С.Ю. Орлова, О.Е. Радченко, М.В. Ерастенкова, А.Ш. Додонова, Е.А. Гаврилькова, М.Н. Ситников, Г.И. Филипенко, С.В. Мурашев // Probl. Cryobiol. Cryomed. — 2019. — Vol. 29, Iss. 1. — P. 44–57. — URL: https://doi.org/10.15407/cryo29.01.044
15. Kushnarenko S. Characterization and cryopreservation of Malus sieversii seeds / S. Kushnarenko, E. Salnikov, M. Nurtazin, Z. Mukhitdinova, I. Rakhimbaev, B.M. Reed // The Asian and Australian Journal of Plant Science and Biotechnology. — 2010. — Vol. 4, special issue 1. — P. 5–9. — URL: https://doi.org/10.13140/RG.2.1.4609.0008.
16. Зорина М.С. Определение семенной продуктивности и качества семян интродуцентов. Методики интродукционных исследований в Казахстане: сб. науч. тр. / М.С. Зорина, С.П. Кабанов. — Алма-Ата: Наука, 1987. — C. 75–85.
17. Кушнаренко С.В. Криоконсервация семян: метод. реком. / С.В. Кушнаренко, З.Р. Мухитдинова, М.М. Аралбаева. — Алматы: Изд-во Ин-та биологии и биотехнологии растений, 2011. — 33 с.
18. Государственная фармакопея СССР. — Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье МЗ СССР. — 11-е изд. — М.: Медицина, 1990. — 400 с.
19. Тлеукенова С.У. Онтогенез ромашки аптечной сорта «Карагандинская» в условиях Центрального Казахстана / С.У. Тлеукенова, С.С. Айдосова, М.Ю. Ишмуратова // Вестн. Казах. нац. ун-та. Сер. биол. — 2008. — № 3. — С. 13–15.
20. Лебига Ю.А. Фармакологическое действие компонентов ромашки аптечной и ее использование в косметических средствах / Ю.А. Лебига, С.Н. Бутова, Е.А. Борисенко // Передовые пищевые технологии: состояние, тренды, точки роста: сб. науч. тр. I Междунар. науч.-практ. конф. — М., 2018. — С. 102–107.
21. Пунегов В.В. Изучение состава эфирного масла ромашки аптечной при интродукции в среднетаежной подзоне Республики Коми / В.В. Пунегов [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://ib.komisc.ru/add/old/t/ru/ir/vt/02–57/05.html.
22. Babar A. Essential oils used in aromatherapy: A systemic review / A. Babar, A.Al-W. Naser, Sh. Saiba, A. Aftab, A. KhShah, A. Firoz // Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. — 2015. — Vol. 5, Iss. 8. — P. 601–611.