Выделение и изучение штаммов фосфатмобилизирующих микроорганизмов, перспективных для создания биоудобрения

В статье описан процесс выделения и изучения штаммов фосфатмобилизирующих микроорганизмов. В результате анализа почвы выявлено, что в отобранных 9 образцах содержится достаточное количество общего азота, гумуса и подвижных соединений фосфора для развития микроорганизмов. В итоге выделения фосфатмобилизующих микроорганизмов были отобраны 23 моноизолята. После инкубации колб провели анализы на содержание растворенного фосфора и рН в культуральной жидкости. В результате наибольшее содержание растворенного фосфора получено при инкубации моноизолятов № 9 и 20, которые составили 3,57 г/л и 2,55 г/л соответственно. Кроме того, рН среды у данных моно- изолятов показал наименьшие значения: 5,4 и 5,7. Моноизоляты № 9 и 20 зашифрованы как FT1 и FT2. На основе физиолого-биохимических исследований выделенные моноизоляты идентифицированы как Bacillus megaterium FT1 и Bacillus sp. FT2. В результате изучения фосфатмобилизирующей активности у выделенных штаммов почвенных фосфатмобилизирующих микроорганизмов и коллекционного штамма наибольшую фосфатмобилизирующую активность показал новый штамм Bacillus megaterium FT1, который в течение 120 ч растворил 100 % фосфора в среде. Выход растворенного фосфора у штаммов Bacillus spp. FT2 и Serratia plymuthica Nl1 составил 50,0 5 и 54,2 % в течение 168 ч.

Введение

Основные приоритеты, стоящие перед агропромышленным комплексом Республики Казахстан — создание устойчивой системы продовольственной безопасности, развитие агробизнеса, снижение импорта продовольствия и повышение конкурентоспособности отечественной продукции. Одним из путей повышения производительности аграрного сектора сельского хозяйства является повышение урожайности используемых почв путем внесения сбалансированных доз органических удобрений, минеральных компонентов, обогащения почв полезной микрофлорой [1].

Разнообразные климатические условия Казахстана позволяют выращивать почти все культуры умеренного теплового пояса — зерновые, плодовоовощные, масличные, технические.

Повышение эффективности аграрного сектора — сложная и многосторонняя задача. Немаловажная роль должна отводиться разработке и внедрению экологически безопасных систем земледелия, составной частью которых являются плодосменные биологизированные севообороты [2], использование органических и биологических удобрений [3], внедрение ресурсосберегающих технологий культивирования [4], использование биологических средств защиты растений. Биологическое направление в создании препаратов для улучшения плодородия постоянно развивается: появляются новые перспективные организмы для создания на их основе биопрепаратов различного действия.

В сельском хозяйстве как основной отрасли, потребляющей фосфорные соединения, проблемы дефицита доступного фосфора в почве решаются путем регулярного внесения минеральных удобрений. Однако только 10–15 % вносимых фосфорных удобрений ассимилируются растениями, а большая часть их переходит в труднодоступную форму для растений или вымывается с грунтовыми водами. Такого неподвижного необменного фосфора в почве содержится очень много: до 5–6 т в каждом гектаре. Фосфатмобилизирующие бактерии живут в почве, разлагают органические вещества и высвобождают содержащийся в них фосфор, переводя его в растворимые соли фосфорной кислоты. Образуемые в дальнейшем соединения фосфорной кислоты становятся доступными для растений.

Наиболее выгодным и экологически безопасным приемом повышения подвижности фосфора в почве и его доступности растениям является микробиологическая фосфатмобилизация — применение бактериальных препаратов, усиливающих мобилизацию фосфора из труднодоступных соединений почвы в легкодоступные.

В связи с изложенным выше, целью данной работы являлось выделение и идентификация активных штаммов фосфатмобилизирующих микроорганизмов для создания биологического удобрения.

Методы исследования

Объектами исследований служили штаммы свободноживущих фосфатмобилизирующих бактерий, выделенные из посадочных участков ТОО «Biolife» (Акмолинская область, г. Степно- горск).

Отбор проб почв проводили в соответствии с ГОСТ 28168–89 [5]. рН почв определяли методом, основанном на вытеснении обменных катионов 1М раствором КСl из почвенного поглощающего комплекса [6], а содержание гумуса в пробах почв — по методике определения качества почвы [7].

Выделение фосфатмобилизующих микроорганизмов проводили на плотной питательной среде NBRIP-BPB и жидкой среде NBRIP [8]. Концентрацию фосфора в растворе определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре Biomate 3 (Thermo Ficher Scientific) [9]. Для постановки титра использовали питательную среду NBRIP.

Количественный учет микроорганизмов проводили методом посева по Коху [10]. Величину рН исследуемых растворов определяли с помощью профессионального многоканального рН-метра Mettler Toledo SevenMulti.

Идентификацию бактерий проводили на основании морфологических, культуральных и физиологических признаков, используя «Определитель бактерий Берджи». Результаты исследования были обработаны с использованием критерия Стьюдента.

Результаты

Выделение почвенных фосфатмобилизирующих микроорганизмов проводили из 9 проб, отобранных на посадочных участках ТОО «Biolife». Ниже в таблице приведены данные анализа отобранных проб.

Таблица Результаты анализа проб почвы

Согласно результатам анализа почвы, в отобранных образцах содержится достаточное количество общего азота, гумуса и подвижных соединений фосфора для развития микроорганизмов.

Образцы почвы массой 5 г смешивали с 100 мл стерильного 0,9 % раствора хлорида натрия, встряхивали на шейкере в течение 8 ч. После образцы вносили в жидкую среду NBRIP, содержащую нерастворимый ортофосфат кальция, и инкубировали на шейкере-инкубаторе 72 ч при температуре 28 ºС и 200 об/мин. При данных условиях преимущественно развивались микроорганизмы, способные к растворению неорганических фосфатов и переводу их в доступные формы. Через 72 ч культивирования готовили последовательные десятикратные разведения полученной суспензии микроорганизмов и высевали на плотную питательную среду NBRIP-BPB для выделения колоний микроорганизмов, способных растворять ортофосфат кальция. При растворении ортофосфата кальция происходило образование зон просветления (зон гало) на изначально мутной среде. После культивирования на среде NBRIP-BPB были отобраны 23 моноизолята, вокруг которых образовывались зоны гало. Отобранные изоляты были пересеяны на среду NBRIP, содержащую нерастворимый ортофосфат кальция, после инкубировали при 28°С и 200 об/мин в течение 72 ч. После инкубации колб провели анализы на содержание растворенного фосфора и рН в культуральной жидкости (рис. 1).

Рисунок 1. Концентрация растворимого фосфора и рН среды после инкубации фосфатмобилизирующих моноизолятов в течение 72 ч

По данным, представленным на рисунке 1, видно, что наибольшее содержание растворенного фосфора получено при инкубации моноизолятов № 9 и 20, которые составили 3,57 г/л и 2,55 г/л соответственно. Кроме того, рН среды у данных моноизолятов показал наименьшие значения: 5,4 и 5,7. Моноизоляты под № 9 и 20 зашифрованы как FT1 и FT2.

Идентификация данных моноизолятов проведена на основании морфологических, культуральных и физиологических признаков с использованием «Определителя бактерий Берджи».

Моноизолят FT1: Клетки прямые палочковидные с закругленными концами, размером 1,9×0,5 мкм, расположенные одиночно, попарно или в виде цепочки, образуют сферические эндоспоры, клетки подвижные. Через 18 ч роста на мясо-пептонном агаре или картофельно-глюкозном агаре клетки образуют колонии грязно-белого цвета. При культивировании штамма на МПА, картофельном агаре, сусло-агаре в течение 24 ч при 28±1 ºС образуются складчатые колонии, вязкой консистенции, телесного цвета. Не растет в анаэробных условиях, oптимальная температура роста 28–31 ºС, pH 6,8–7,2. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа. Гидролизует крахмал, желатин, не гидролизует мочевину.

Моноизолят FT2: Грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На мясо-пептонном агаре, сусло-агаре дают обильный рост. На МПА образует сероватобелые мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки сероватобелого цвета и осадка. Оптимальная температура роста 28–30 ºС. Через 18 ч роста в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки, размером 2–3×0,6 мкм, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры овальные, размер 0,9×0,6 мкм, расположены в клетке центрально или эксцентрично. Культура ферментирует глюкозу, сахарозу, маннит и мальтозу. Гидролизует крахмал, желатин, не гидролизует мочевину.

На основе физиолого-биохимических исследований выделенные моноизоляты идентифицированы как Bacillus megaterium FT1 и Bacillus sp. FT2.

Изучение фосфатмобилизирующей активности у выделенных штаммов Bacillus megaterium FT1, Bacillus sp. FT2 и штамма Serratia plymuthica Nl1, взятого из коллекции штаммов микроорганизмов филиала «Национальный центр биотехнологии» в г. Степногорске, проводили на жидкой среде NBRIP, содержащей нерастворимый ортофосфат кальция, в течение 168 ч. Содержание растворенно-

39

го фосфора определяли каждые 24 ч. Результаты по содержанию растворенного фосфора и данные по рН представлены на рисунке 2.

Результаты исследований, представленные на рисунке 2а, показали, что наибольшая фосфатмо- билизирующая активность наблюдается у штамма Bacillus megaterium FT1, который в течение 120 ч растворил 100 % фосфора. Выход растворенного фосфора у штаммов Bacillus sp. FT2 и Serratia plymuthica Nl1 составил 50,0 и 54,2 % соответственно в течение 168 ч. Концентрация растворимого фосфора коррелирует с понижением рН среды в соответствии с рисунком 2б. В результате наибольшую активность показали штаммы Bacillus megaterium FT1 и Serratia plymuthica Nl1, которые были выбраны для дальнейшего создания комплексного органического биоудобрения. На рисунке 3 представлен регрессионный анализ корреляции между рН и содержанием фосфора в культуральной жидкости для всех исследуемых фосфатмобилизирующих штаммов.

Таким образом, в мобилизации фосфора значительную роль играет снижение рН среды за счет образования кислоты бактериями. Наибольшее растворение фосфора наблюдалось при значениях рН меньше 6,0.

Заключение

С целью создания органического удобрения, перспективного для выращивания органической продукции и повышения плодородия почвы, были выделены свободноживущие фосфатмобилизи- рующие бактерии и изучена фосфатмобилизирующая активность.

Проведен подбор штаммов и отобраны 2 штамма фосфатмобилизирующих бактерий Bacillus megaterium FT1 и Serratia plymuthica Nl1.

В результате изучения фосфатмобилизирующей активности у выделенных штаммов почвенных фосфатмобилизирующих микроорганизмов и коллекционного штамма наибольшую фосфатмобили- зирующую активность показал новый штамм Bacillus megaterium FT1, который в течение 120 ч растворил 100 % фосфора в среде. Выход растворенного фосфора у штаммов Bacillus spp. FT2 и Serratia plymuthica Nl1 составил 50,0 5 и 54,2 % в течение 168 ч соответственно.

Данная работа была выполнена в рамках научно-технической программы О.0810 «Создание новых препаратов и инновационных биотехнологий для сельского хозяйства и ветеринарии» на 2018– 2020 годы.

Список литературы

1 Послание Президента Республики Казахстан Н. Назарбаева народу Казахстана. «Третья модернизация Казахстана: глобальная конкурентоспособность» от 31 января 2017 года [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.akorda.kz/ru/addresses/addresses_of_president/poslanie-prezidenta-respubliki-kazahstan-nnazarbaeva-narodu-kazah- stana-31-yanvarya-2017-g (дата обращения 14.04.2020).

2 Crotty F.V. Understanding the Legacy Effect of Previous Forage Crop and Tillage Management on Soil Biology, after Conversion to an Arable Crop Rotation / F.V. Crotty, R. Fychan, R. Sanderson, J.R. Rhymes, F. Bourdin, J. Scullion // Soil Biology and Biochemistry. — 2016. — Vol. 103. — P. 241–252.

3 Sattar A. Perspectives of Potassium Solubilizing Microbes in Sustainable Food Production System: A Review / A. Sattar, M. Naveed, M. Ali, A. Zahir, M.S. Nadeem, M. Yaseen [Electronic resource]. — URL: https://www.researchgate.net/publication/327776810_Perspectives_of_potassium_solubilizing_microbes_in_sustainable_food_produ ction_system_A_review (дата обращения 14.04.2020).

4 Muriu-Ng'ang'a F.W. Socio-Economic Factors Influencing Utilisation of Rain Water Harvesting and Saving Technologies in Tharaka South, Eastern Kenya / F.W. Muriu-Ng'ang'a, M. Mucheru-Muna, F. Waswa, F.S. Mairura // Agricultural Water Management. — 2017. — Vol. 194. — P. 150–159.

5 ГОСТ 28168–89. Почвы. Отбор проб.

6 ГОСТ 26425–85. Почва. Метод определения ионов хлорида в водной вытяжке.

7 Александрова Л .Н. Лабораторно-практические занятия по почвоведению / Л .Н. Александрова, О.А. Найденова. — Л.: Наука, 1986. — 224 с.40

1. Yasmin H. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from rhizosphere soil of weeds of khewra salt range and attock / H. Yasmin, A. Bano // Pakistan Journal of Botany. — 2011. — № 3. — Р. 1663–1668.
2. ГОСТ 26211–91. Почвы. Определение подвижных соединений фосфора по методу Аррениуса в модификации ВИУА.
3. Нетрусова А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусова. — М.: Академия, 2005. — 608 с.