АННОТАЦИЯ
Исследование проведено на 52 половозрелых крысах линии Вистар в течение 30 дней с целью изучения влияния сочетанной нитратной и фторидной интоксикации на генерацию супероксидного анион- радикала (·〇2_), функционирование ферментативных антиоксидантных систем, интегральный показатель антиоксидантной защиты и показатели пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в слизистой оболочке желудка крыс. Анализ результатов позволил установить синергическое влияние фторидной и нитратной интоксикации на процессы ПОЛ. Влияние на генерацию ·О2_ и антиоксидантные системы имеет более сложное взаимодействие.
Введение. В некоторых регионах Полтавской области существует проблема повышенного содержания фторидов в питьевой воде (Карловский, Машевский, Шишацкий районы) [3]. Схожая ситуация наблюдается в южных районах Республики Казахстан (г. Алматы и некоторые города Акмолинской области) [5]. В связи с повышенным использованием органических и неорганических нитратов в сельском хозяйстве их поступление в организм человека в последние годы также повысилось [6]. Это создает условия, при которых возможно одновременное действие на организм человека двух этих патогенов. Нитрат натрия способен ингибировать избыточную генерацию супероксидного анион-радикала путем угнетения экспрессии индуцибельной NO-синтазы (iNOS, Е.С. 1.14.13.39) [8, 13]. Фторид натрия способен индуцировать выработку супероксида [9-12]. Фтор среди прочего способен ингибировать активность ферментативных антиоксидантных систем организма, тем самым усиливая оксидаци- онный стресс [9, 11]. Также есть данные о том, что избыточное количество нитратов может вызывать усиление пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и снижение ферментативных антиоксидантных систем [8]. Поскольку эти вещества в основном поступают в организм peros (с водой и продуктами питания), то система пищеварения первой испытывает их негативное влияние. Одновременное воздействие двух этих патогенов на слизистую оболочку желудка является недостаточно изученным.
Цель исследования - изучение влияния сочетанной нитратной и фторидной интоксикации на генерацию супероксидного анион-ради- кала (·〇2¯), функционирование ферментативных антиоксидантных систем, интегральный показатель антиоксидантной защиты и показатели ПОЛ в слизистой оболочке желудка крыс.
Материалы и методы. Опыты проведены на 52 половозрелых крысах линии Wistar. Хроническое избыточное поступление нитратов и фторидов и их сочетанное поступление моделировали путем введения нитратов через желудочный зонд из расчета 500 мг/кг, фторидов - из расчета 10 мг/кг. Нитраты и фториды вводили в течение 30 дней. Все манипуляции проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для иссле-
Таблица 1
Генерация супероксидного анион-радикала, состояние процессов ПОЛ и активность антиоксидантных систем в слизистой оболочке желудка крыс, М±т
|
Интактные |
Фторидная |
Нитратная |
Сочетанная |
|
|
животные, |
интоксикация |
интоксикация, |
интоксикация, |
|
|
n=10 |
10 мг/кг, п=13 |
500 мг/кг, n=14 |
п=15 |
Генерация •Ог¯, нмоль/г■с
|
Базовая |
0,4±0,01 |
0,61±0,02* |
0,82±0,02*" |
1,18±0,01*'***# |
|
НАДФН-зависимыеЭТЦ |
7,17±0,16 |
11,4±0,09* |
10,0±0,16*" |
8,04±0,22*'***/# |
|
НАДН-зависимыеЭТЦ |
4,9±0,23 |
5,32±0,08* |
9,4±0,12*" |
8,15±0,22*'***/# |
|
НАДФН-оксидаза лейкоцитов |
1,33±0,03 |
2,05±0,02* |
1,26±0,03*z** |
1,76±0,02*'***/# |
|
Содержание ТБК-реактантов,мкмоль |
||||
|
До инкубации |
6,1±0,25 |
17,35±0,44* |
8,93±0,2*" |
13,65±0,11*'***/# |
|
Послеинкубации |
18,2±0,32 |
32,77±0,59* |
25,57±0,24*'** |
34,18±1,38*'***/# |
|
Прирост |
12,09±0,29 |
15,42±0,88* |
16,64±0,23* |
20,53±1,33*'***/# |
|
Активность SOD, у.е. |
0,73±0,14 |
0,26±0,05* |
1,16±0,1*'** |
0,33±0,02*/# |
|
Активность CAT, нкат/г |
204±4 |
356±32* |
145±15*'** |
136±10*'*** |
- Данные статистически значимо отличаются от интактной группы с p<0,05.
** Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с p<0,05.
*** Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с p<0,05.
- Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с p<0,05.
довательских и других научных целей». Животные были разделены на 4 группы:
- первая - интактные животные (n=10);
- вторая - группа фторидной интоксикации (n=13);
- третья - группа нитратной интоксикации (п-14);
- четвертая - группа с сочетанной интоксикацией (n=15).
Продукцию супероксидного анион-радикала (·〇2¯) исследовали модифицированным спектрофотометрическим методом при проведении теста с нитросиним тетразоли ем [2]. Для оценки его генерации НАДФН-зависимы- ми (микросомальными) электронно-транспортными цепями (ЭТЦ) и от NO-синтазы, НАД- Н-зависимым (митохондриальным) ЭТЦ и НАДФН-оксидазы лейкоцитов вводили индукторы в виде НАДН, НАДФН и бактериального липополисахарида (пирогенал). Модификация метода заключалась в том, что при оценке индукции пирогеналом тритон X-IOO вводился после 30-минутной инкубации. Это позволяет сохранить мембраны лейкоцитов неповреждёнными во время инкубации, а после неё облегчает выход ∙O2- из лейкоцитов. Таким образом, точность оценки индукции пирогеналом повышается.
О показателях ПОЛ судили по количеству веществ, образующихся в реакции с тиобарби- туровой кислотой (ТБК-реактантов) [7] и их приростом после инкубации в железо-аскорбатном буферном растворе. Определение активности супероксиддисмутазы (SOD, Е.С.1.15.1.1.) Проводили по определению ингибирования автоокисления адреналина в щелочной среде [4], каталазы (CAT, Е.С. 1.11.1.6.) - по убыванию содержания перекиси водорода в присутствии пробы [1]. Спектрофотометрические исследования проводились на фотоэлектрокалориметре «РМ-2111 Solar» (Беларусь). Результаты подвергались статистическому анализу методом ANOVA, с последующим анализом по Геймсу - Ховелу с поправкой по Данн - Сидаку. Статистическая обработка проводилась с помощью программы MicrosoftExcel и расширения Real Statistic.
Результаты. Изолированная фторидная интоксикация увеличивает базовую генерацию на 52,5 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы (NOS) - на 59 %, митохондриальным ЭТЦ на 8,6 %, от лейкоцитов ткани - на 54,1 %. Нитратная интоксикация показала другую динамику: базовая генерация ∙02- увеличена на 105 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы - на 39,5 %, митохондриальным ЭТЦ - на 91,8 %, от лейкоцитов ткани генерация уменьшилась - на 5,3 %. Хотя нитраты и фториды имеют тенденцию к усилению генерации ·〇2- митохондриальным ЭТЦ, нитраты увеличивают генерацию на 76,69 %, относительно фторидной интоксикации, что объясняется влиянием нитратов на ЭТЦ митохондрий [10]. Генерация ·〇2- микросомальным ЭТЦ и от NOS также имеет тенденцию к увеличению относительно интактной группы, однако фториды на 14 % сильнее индуцируют генерацию ·〇2¯ микросомальным ЭТЦ и от NOS, что связано с активацией ионами фтора различных изоформ NOS [10]. Влияние на НАДФН-оксидазу лейкоцитов носит разнонаправленный характер, что может быть связано с ингибирующим эффектом нитратов на iNOS [10, 13].
Сочетанное избыточное поступление нитратов и фторидов увеличивает базовую генерацию ·〇2- на 93 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы - на 12 %, НАДН митохондриальным ЭТЦ - на 66 %, от лейкоцитов ткани - на 33 %. Таким образом, можно сделать вывод об синергическом эффекте нитратов и фторидов на базовую генерацию ∙O2-. Сочетанное влияние фторидов и нитратов на микросомальные ЭТЦ оказывает выраженный антагонизм этих факторов: снижение генерации ·〇2¯ на 29,47 % относительно фторидной интоксикации и на 19,6 % относительно нитратной.
Активность SOD при изолированной фторидной интоксикации снижается на 64,38 %, CAT повышается на 78,92 %. При нитратной интоксикации SOD повышается на 58,9 %, CAT - сни-
жается на 28,9 2 %. При сочетанной патологии активность SOD снижается на 54,79 %, CAT - снижается на 33,33 %. При сочетанном введении нитратов и фторидов достоверных различий в активности SOD при сравнении с фторидной группой не наблюдается. В ходе анализа активности CAT достоверных различий между нитратной и сочетанной интоксикациями также не обнаружено.
При анализе количества ТБК-реактантов примечательна тенденция к увеличению их содержания до инкубации как при фтористой интоксикации (на 184 %), так и при нитратной (на 46,39 %). Сочетанная интоксикация повышает содержание ТБК-реактантов на 124 %. Прирост ТБК-реактантов при сочетанной интоксикации увеличивается на 33,1 % при сравнении с фторидной, и на 23,38 % - при сравнении с нитратными интоксикациями. Это позволяет сделать заключение о синергетическом угнетающем эффекте нитратной и фторидной интоксикации на не ферментативную антиоксидантную систему.
Выводы
Сочетанная нитратная и фторидная интоксикация оказывает синергетический эффект на базовую генерацию ∙O2- и прирост ТБК-реактантов. Стимулированные генерации от микросомальных и митохондриального ЭТЦ имеют антагонистическую динамику. Ферментативные же антиоксидантные системы показали определенную тропность к ионам фтора (преимущественно CAT) и нитрат-ионам (SOD).
ЛИТЕРАТУРА
- Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
- Костенко В.О., Цебржинсъкий 0.1. Продукцǐя супероксидного анǐон-радикала та оксиду азоту у тканинİ нирок після хірургічного втручання // Фізіолог. жури. - 2000. - T 46, № 5. - С. 56-62.
- Назаренко Е.А., Нікозятъ Ю.Б., ìващенко О.Д. Проблеми забруднення фторидамигрунтів і вод геохİмǐчноï провінцй (на прикладǐ Полтавськоï областǐ) // Екологǐчна безпека. - 2014. - № 1. - С.59-63.
- Методи клİнİчних та експериментальних дослǐджень в медицинǐ ⁄ [Л.В.Беркало, О.В.Бобо- вич, Н.О.Боброва та ед.] // пǐд ед. Ī.П.Кайдашев. - Полтава: Полǐмет, 2003. - 96-99 с.
- Серикбаева А.К Качество природных вод Республики Казахстан ⁄ А.К.Серикбаева, Л.М.Са- таева, А.М.Азимов // Междунар. науч, ин-т «Educatio». - 2015. - № 2 (9). - С. 21-23.
- Смоляр B.I. Нітрати, нǐтрити та нітрозоаміни у харчових продуктах і раціонах ⁄ В.Ī.Смоляр, О.Ì.Циганенко, Г.ТПетрашенко // Проблеми харчування. - 2007. - № 3. - С. 35-44.
- Стальная ИД. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - M.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
- Bouaziz-Ketata H. Nitrate-induced Biochemical and Histopathological Changes in the Liver of Rats: Ameliorative Effect OfHyparrheniahirta / H-Bouaziz-Ketata, G.B.Salah, H.B.Salah [et al.] // Biomed Environ Sci. - 2014. - Vol. 27 (9). - P. 695-706.
- Fina B.L., Lombarte M., Rigalli JP et al. Fluoride increases superoxide production and impairs the respiratory chain in ROS 17/2.8 osteoblastic cells // PLOS ONE. - 2014. - Vol. 9. - Is. 6. - P. 1-6.
- Romero-Puertas M.C., Sandalio L.M. Nitric oxide level is self-regulating and also regulates its ROS Partners // Front. Plant. Sci. - 2016. - Vol. 7. - Is. 316. - P. 1-6.
- Shivarayaschankara YM., Shivashankara A.R., Bhat PG. et al. Effect of fluoride intoxication on lipid peroxidation and antioxidant systems in rats / Y.M. Shivarayaschankara // Fluoride. - 2001. - Vol. 34. - P. 108-113.
- Shushua X., Ziyou L., Ling Y. et al. ARole of Fluoride on Free Radical Generation and Oxidative Stress in BV-2 Microglia Cells // Mediators Imflamm. - 2012. - Vol. 13. - Art. 102954. - P. 1-8.
- Yang T., Pelleli M., Zollbrecht C. et al. Inorganic nitrite attenuates NADPH oxidase-derived superoxide generation in activated macrophages via a nitric oxide-dependent mechanism // Free Radic. Biol. Med. - 2015. - Vol. 83. - P. 159-166.