Выделение перспективных штаммов Bacillus megaterium и Bacillus subtilis, обладающих фосфатмобилизирующими и противомикробными свойствами

В статье представлены данные по выделению и изучению физиолого-биохимических свойств культур Bacillus megaterium и Bacillus subtilis. В качестве материалов для выделения культур использовались образцы черноземных почв пшеничных полей. Из образцов выделены 36 изолятов с противо- микробными и 17 изолятов с фосфатмобилизирующими свойствами. Микроскопическое наблюдение этих изолятов показало, что они представляют собой грамположительные, палочковидные, эндоспорообразующие бактерии. Согласно культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам выделенные изоляты идентифицированы как Bacillus subtilis и Bacillus megaterium. Изучена эффективность фосфатмобилизации штаммов Bacillius megaterium. В результате из выделенных 17 изолятов 5 показали наибольшую солюбилизирующую способность на твердой среде. Определена солюбилизирующую способность на жидкой среде NBRIP, где содержание растворенного фосфора увеличилось в 4–7 раза, а рН культуральной жидкости у данных штаммов уменьшился с 7,0 до 5,1–5,4. Также проведены работы по изучению антагонистической активности выделенных штаммов Bacillus subtilis и Bacillus megaterium к 2 тест-штаммам: Fusarium graminearum и Fusarium oxysporum. На основании полученных данных отмечено, что штаммы Bacillius megaterium АА4, АА7, АА8, АА15 и АА17, а также Bacillus subtilis AS7, AS14, AS22, AS29 и AS34 обладают антагонистической активностью по отношению к F. graminearum и F. oxysporum. Таким образом, получены перспективные штаммы для биоконтроля фузариозных заболеваний.

Введение

В последние годы возрос интерес к изучению биологического контроля фитопатогенов с помощью полезных растительных микроорганизмов, особенно бактерий, о чем свидетельствует экспоненциальный рост мирового рынка биопестицидов с 800 млн долл. США в 2014 г. до 2,8 млрд долл. США на настоящее время [1]. Многие бактериальные роды, такие как Paenibacillus, Pseudomonas, Burkholderia, Lysobacter и Bacillus, были описаны как симбиотические микроорганизмы с биоконтролирующей способностью [2–4]. Эта группа микробов ингибирует развитие болезни, препятствуя образованию фитопатогенов, благодаря продуцированию внеклеточных ингибирующих молекул, таких как литические ферменты, токсины, сидерофоры, биосурфактанты и активации сигналов защиты растений [2, 5, 6]. Недавние работы свидетельствуют об успешном использовании бактерий для борьбы с грибковыми заболеваниями у нескольких экономически важных культур, например, кукурузы [7], фасоли обыкновенной [8], сои [9], при этом наблюдалось снижение тяжести заболевания (> 60 %) и улучшение фитосанитарного состояния растений.

В настоящее время в Казахстане для борьбы с патогенами зерновых культур преимущественно используются химические препараты на основе ципроконазола, имазалила, тебуконазола, беномила, тирама, флудиоксонила и других антимикотических препаратов. Использование химических фунгицидов в сельском хозяйстве имеет ряд недостатков: формирование стойких рас возбудителей, токсичность для теплокровных млекопитающих и человека, ингибирование ризосферных микроорганизмов.

Подобными недостатками не обладают биологические фунгициды на основе почвенных микроорганизмов. Предварительная обработка семян перед высевом бактериальными препаратами, обладающими фунгицидной активностью, позволяет снизить поражение посевов на начальных этапах культивирования. Оздоровление почвы и предотвращение заражения растений на ранних стадиях развития возможны при непосредственном внесении в почву микроорганизмов, синтезирующих фунгицидные вещества. В связи с этим выделение штаммов B. subtilis, В. megaterium и исследованиеих фосфатмобилизирующей и антагонистической активности по отношению к фузариозным грибам являются важными в развитии биоконтрольных агентов.

Материалы и методы исследования

В качестве материалов исследования использовались микроорганизмы с фосфатмобилизирую- щей и противомикробной активностью рода Bacillus.

В работе были использованы следующие питательные среды:

Картофельно-декстрозный агар, (г/л): отвар картофеля — 200; декстроза — 20; агар-агар — 20; пептон — 10.

Жидкая среда NBRIP, (г/л): глюкоза — 10,0; Ca₃(PO₄)₂ — 5,0; MgCl₂^H₂O — 5,0; MgSO._l-7l I₂O — 0,25; KCl — 2,0; (NH4)2SO4 — 0,1. pH 6,8–7,0.

Твердая питательная среда NBRIP-BPB, (г/л): глюкоза — 10,0; Ca₃(PO₄)₂ — 5,0; MgCl₂^6H₂O — 5,0; MgSO<7H₂O — 0,25; KCl — 2,0; (NH₄)₂SO₄ — 0,1; агар — 15,0; бромфеноловый синий — 0,025. pH 6,8–7,0.

Отбор проб почв проводили в соответствии с ГОСТом 28168–89 [10]. Выделение фосфатмобили- зующих микроорганизмов проводили на плотной питательной среде NBRIP-BPB и жидкой среде NBRIP [11].

Концентрацию фосфора в растворе определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре Biomate 3 (Thermo Ficher Scientific) [12].

Антагонистическую активность микроорганизмов по отношению к фитопатогенным грибам изучали на картофельно-декстрозном агаре методом агаровых блоков [13]. В качестве тест- организмов использовали фитопатогенные штаммы, взятые из коллекции штаммов микроорганизмов филиала «Национальный центр биотехнологии» в г. Степногорске: Fusarium graminearum — возбудитель фузариоза колоса пшеницы, Fusarium oxysporum — возбудитель фузариозной корневой гнили пшеницы.

Количественный учет микроорганизмов велся методом серийных разведений, методом прямого подсчета в камере Горяева и методом посева по Коху [14].

Результаты

Выделение микроорганизмов с фосфатмобилизирующей активностью проводили из образцов черноземных почв пшеничных полей КХ «Азамат» (Акмолинская область, село Азат).

Bacillus megaterium является представителем эффективной микрофлоры плодородных почв. Как характерно для многих почвенных бактерий, Bacillus megaterium образует эндоспоры. С целью выделения Bacillus megaterium образцы почвы нагревали для уничтожения неспорообразующих мезофиллов. Затем образцы почвы (0,5 г) смешивали с 50 мл стерильной дистиллированной воды, встряхивали на шейкере в течение 2 ч. Образцы вносили в жидкую среду NBRIP (5 мл на 100 мл среды), инкубировали на шейкере-инкубаторе 48 ч при температуре 28 °С и 190 об/мин. При данных условиях преимущественно развиваются микроорганизмы, способные к растворению трикальцийфосфата и переводу его в доступную для растений форму. Через 48 ч культивирования готовили последовательные десятикратные разведения полученной суспензии микроорганизмов и проводили поверхностный высев на плотную питательную среду Герретсена с трикальцийфосфатом. При растворении трикальцийфосфата происходило образование зон просветления (зон гало) на изначально мутной среде.

В результате выполненных работ выделены 17 изолятов с фосфатмобилизирующей активностью. Идентификацию изолятов проводили на основании морфологических, культуральных и физиологических признаков, используя «Определитель бактерий Берджи». Все изоляты образовывали полностью белые, округлые, гладкие и блестящие колонии. Микроскопическое наблюдение этих изоля- тов показало, что они представляют собой грамположительные, палочковидные эндоспорообразующие бактерии. Согласно физиолого-биохимическим признакам выделенные изоляты идентифицированы как Bacillius megaterium.

Эффективность фосфатмобилизации штаммов Bacillius megaterium была протестирована на твердой среде NBRIP с добавлением бромфенолового синего (NBRIP-BPB). При изменении реакции среды в кислую сторону под действием микробных метаболитов происходило просветление питательной среды. Результаты тестов представлены в таблице 1.

Таблица 1 Зона солюбилизации, производимая штаммами Bacillus megaterium

Как видно из данных, представленных в таблице 1, все выделенные штаммы обладают способностью к солюбилизации фосфора.

У штаммов, показавших наибольшую солюбилизирующую способность на твердой среде АА4, АА7, АА8, АА15 и АА17, была определена солюбилизирующая способность на жидкой среде NBRIP, содержащей нерастворимый ортофосфат кальция. После инкубации колб в течение 72 ч при 28 ºС и 200 об/мин провели анализы на содержание растворенного фосфора и рН в культуральной жидкости. Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2

Концентрация растворенного фосфора и рН среды после инкубации фосфатмобилизирующих штаммов в течение 72 ч на жидкой среде NBRIP

По данным таблицы 2 видно, что содержание растворенного фосфора увеличилось в 4–7 раза. Также рН культуральной жидкости у данных штаммов уменьшился с 7,0 до 5,1–5,4. Таким образом, солюбилизация фосфора коррелирует со снижением рН среды бактериями.

Выделение микроорганизмов с антагонистической активностью проводили аналогично по методике выделения Bacillus megaterium. Как характерно для многих почвенных бактерий, Bacillus subtilis образует эндоспоры.

Также из образцов почвы было выделено 36 изолятов с антимикробной активностью. Из них 15 показали явную антагонистическую активность против F. graminearum и F. oxysporum. Согласно культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам выделенные изоляты идентифицированы как Bacillius subtilis.

Антагонистическую активность выделенных штаммов Bacillus subtilis и штаммов Bacillus megaterium, показавших наибольшую солюбилизирующую способность, исследовали к 2 тест-штам- мам: Fusarium graminearum (фузариоз колоса пшеницы) и Fusarium oxysporum (фузариозная корневая гниль пшеницы) методом агаровых блоков. Результаты представлены в таблице 3.

По результатам, представленным в таблице 3, видно, что штаммы Bacillius megaterium АА4, АА7, АА8, АА15 и АА17, а также Bacillus subtilis AS7, AS14, AS22, AS29 и AS34 обладают антагонистической активностью по отношению F. graminearum и F. oxysporum. На рисунке представлены in vitro тесты по антагонистической активности изолята AS29 в отношении F. graminearum и F. oxysporum на картофельно-декстрозном агаре на 5-й день инкубации при 28 ºС.

Таблица 3 Антагонистическая активность штаммов против F. graminearum и F. oxysporum на картофельно-декстрозном агаре

Заключение

В результате проведенных работ из образцов черноземных почв пшеничных полей выделены и изучены физиолого-биохимические свойства культур Bacillus megaterium и Bacillus subtilis. Согласно культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам выделенные изоляты идентифицированы как Bacillus subtilis и Bacillus megaterium. Изучена эффективность фосфатмобили- зации штаммов Bacillius megaterium. В результате из выделенных 17 изолятов 5 показали наибольшую солюбилизирующую способность на твердой среде. Определена солюбилизирующая способность на жидкой среде NBRIP, где содержание растворенного фосфора увеличилось в 4–7 раза, а рН культуральной жидкости у данных штаммов уменьшился с 7,0 до 5,1–5,4. Также проведены работы по изучению антагонистической активности выделенных штаммов Bacillus subtilis и Bacillus megaterium к 2 тест-штаммам: Fusarium graminearum и Fusarium oxysporum. На основании полученных данных штаммы Bacillius megaterium АА4, АА7, АА8, АА15 и АА17, а также штаммы Bacillus subtilis AS7, AS14, AS22, AS29 и AS34 обладают антагонистической активностью по отношению F. graminearum и F. oxysporum.

Данная работа была выполнена в рамках проекта BR06349586 НТП «Трансферт и адаптация технологий по точному земледелию при производстве продукции растениеводства по принципу «демонстрационных хозяйств (полигонов)» в Акмолинской области» на 2018–2020 гг.

Список литературы

1. Gouda S. Revitalization of plant growth promoting rhizobacteria for sustainable development in agriculture / S. Gouda, R.G. Kerry, G. Das, S. Paramithiotis, H.-S. Shin, J.K. Patra // Microbiol. Res. — 2018. — Vol. 206. — P. 131–140. https://doi.org/10.1016/J.MICRES.2017.08.016
2. Pérez-Montaño F. Plant growth promotion in cereal and leguminous agricultural important plants: From microorganism capacities to crop production / F. Pérez-Montaiio. C. AUas-Villegas, R.A. Bellogm, P. del Cerro, M.R. Espuny, I. Jiménez-Guerrero, F.J. L0pez-Baena, F.J. Ollero, T Cubo // Microbiol. Res. — 2014. — Vol. 169. — P. 325-336. https://doi.org/10.1016/ J.MICRES.2013.09.011
3. Shailendra Singh G.G. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Current and Future Prospects for Development of Sustainable Agriculture / G.G. Shailendra Singh // J. Microb. Biochem. Technol. — 2015. — Vol. 7. — P. 96–102. https://doi.org/ 10.4172/1948–5948.1000188
4. Ahemad M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective / M. Ahemad, M. Kibret // J. King Saud Univ. Sci. — 2014. — Vol. 26. — P. 1–20. https://doi.org/10.1016/J.JKSUS.2013.05.001
5. Villarreal-delgado M.F. The genus Bacillus as a biological control agent and its implications in the agricultural biosecurity / M.F. Villarreal-delgado, E.D. Villa-rodriguez, L.A. Cira-chávez, M. Isa-, I. T Sonora, D.F. De Sur, C.C. Cp // Mexican Journal of Phytopathology. — 2018. — P. 95-130. https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT. 1706-5
6. Figueroa-L0pez A.M. Rhizospheric bacteria of maize with potential for biocontrol of Fusarium Verticillioides / A.M. Figueroa-L0pez, J.D. Cordero-Ramirez, J.C. Martinez-Alvare/, M. L0pez-Meyer, G.J. Lizarraga-Sanchez, R. Félix-Gastélum, C. Castro-Martinez, I.E. Maldonado-Mendoza // Springerplus. — 2016. — Vol. 5. — P. 330. https://doi.org/10.1186/s40064-016- 1780-x
7. Sabaté D.C. Biocontrol of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary on common bean by native lipopeptide-producer Bacillus strains / D.C. Sabaté, C.P. Brandan, G. Petroselli, R. Erra-Balsells, M.C. Audisio // Microbiol. Res. — 2018. — Vol. 211. — P. 2130. https://doi.org/10.1016/J.MICRES.2018.04.003
8. Arfaoui A. Isolation and identification of cultivated bacteria associated with soybeans and their biocontrol activity against Phytophthora sojae / A. Arfaoui, L.R. Adam, A. Bezzahou, F. Daayf // BioControl. — 2018. — Vol. 63. — P. 1-11. https://doi.org/10.1007/s10526-018-9873-9
9. Li H. Biological control of wheat stripe rust by an endophytic Bacillus subtilis strain E1R-j in greenhouse and field trials / H. Li, J. Zhao, H. Feng, L. Huang, Z. Kang // Crop Prot. — 2013. — Vol. 43. — P. 201-206. https://doi.org/10.1016/ J.CROPRO.2012.09.008
10. ГОСТ 28168-89. Почвы. Отбор проб.
11. Yasmin H. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from rhizosphere soil of weeds of khewra salt range and attock / H. Yasmin, A. Bano // Pakistan Journal of Botany. — 2011. — No. 3. — Р. 1663-1668.
12. ГОСТ 26211-91. Почвы. Определение подвижных соединений фосфора по методу Аррениуса в модификации ВИУА.
13. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. — М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. — 503 c.
14. Нетрусова А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусова. — М.: Академия, 2005. — 608 c.