Сохранение генетического материала некоторых видов барбариса в криобанке

В результате работ по введению в культуру in vitro и микроклональному размножению создана коллекция in vitro растений барбариса, состоящая из 41 образца. Полученная коллекция in vitro заложена на среднесрочное хранение (хладохранение) при температуре 4 ºС. Максимальная продолжительность хладохранения составляет 12 месяцев. Семена барбариса помещены в криобанк при температурах –196 ºС и –20 ºС. Способность семян к прорастанию после хранения в течение 2 лет при низкой и сверхнизкой температурах в среднем по образцам составляет 86,7 %. Не выявлена статистически достоверная разница всхожести свежесобранных семян и семян после хранения при температурах –20 ºС и –196 ºС у всех изученных образцов барбариса. Отмечено, что процент всхожести семян, хранившихся при низких температурах, несколько выше процента всхожести свежесобранных семян. Созданный криобанк семян барбариса послужит надежным хранилищем генетического материала этого ценного пищевого и лекарственного растения.

Введение

Барбарис — уникальное растение, являющееся огромным кладезем полезных веществ, обладающее множеством лечебных качеств. Известно около 500 видов растений этого рода, распространенных в Европе, Азии и в Северной Америке. В Казахстане произрастает Berberis iliensis M. Pop. в ущельях восточной части Заилийского Алатау, Кетменского хр., Джунгарского Алатау, в устьях рек Чилик, Ча- рын, впадающих в р. Или; Berberis integerrima Bunge — в Тянь-Шане, Памиро-Алтае, Каратау; Berberis karkaralensis Kornilova et Potapov — в Каркаралинских горах, в массиве Кент; Berberis kashgarica Rupr. — в Тянь-Шаньских горах; Berberis nummularia Bunge — в прибалхашских пустынях долины р. Или, в Джунгарском Алатау, Тянь-Шани, Памиро-Алтае; Berberis oblonga (Regel) C.K. Schneid. — в ущельях Тянь-Шаня; Berberis sibirica Pall. — Алтай и Джунгарский Алатау; (Berberis sphaerocarpa Kar. Et Kir., синонимы: Berberis bykovianus Pavl. и Berberis heteropoda Schrenk — в Алтае, Тарбагатае, Зай- сане, Чу-Илийских горах, в Джунгарском, Заилийском и Кунгей Алатау [1].

Полезные свойства барбариса известны человеку не одну тысячу лет. Ягоды барбариса используются в народной медицине для лечения широкого спектра заболеваний. Имеется достаточное количество зарубежной литературы, где авторами приводятся полученные результаты о положительном влиянии фармацевтических препаратов на основе барбариса. Эти препараты используются при лечении рака, сахарного диабета, ишемии мозга, сердечно-сосудистых заболеваний, бактериальных, вирусных, паразитарных поражений, а также обладают спазмолитическими свойствами при холециститах, оказывают гипотензивное действие, усиливают сократительную способность матки, стимулируют действие системы свертывания крови и других [2-6].

На данный момент складывается неблагоприятная обстановка с сокращением массивов тугайных лесов в пойме реки Или и ее притоков. Основную массу таких лесов составляет барбарис илийский. Барбарис каркаралинский также находится в критическом состоянии, его популяции фрагментированы, хотя он произрастает на защищённых территориях в Центральном Казахстане. Два этих вида уже сейчас занесены в Красную книгу Казахстана, в ближайшее время другие виды барбариса могут оказаться под угрозой исчезновения [7, 8].

Принимая во внимание все полезные свойства барбариса, отмеченные еще нашими предками, важно изучить и сохранить его уникальные виды, которые находятся под угрозой исчезновения. Решением проблемы сохранения послужит культивирование редких и исчезающих видов в коллекциях in vitro при температуре +24 ºС и при пониженных температурах +4 ºС (хладохранение); сохранениесемян при температуре –20 ºС; а также криоконсервация при температуре –196 ºС в жидком азоте семян и апикальных меристем [9–11]. Генетические банки сберегают семена растений в защищенных местах по всему миру. Образцы хранятся в течение долгого периода времени, длительность хранения возможна и тысячи лет.

Апикальные меристемы и семена барбариса, сохранённые в криобанке, и растения in vitro, заложенные на хладохранение, послужат для проведения широкого спектра биологических и медицинских исследований. В первую очередь это касается разработки надежной методологии сохранения генетических ресурсов, особенно редких и исчезающих видов с дальнейшей реинтродукцией в естественные места обитания, а также для создания маточников в питомниках, заказниках и др. Созданная криоколлекция может быть использована в селекционном процессе по улучшению существующих и созданию новых сортов, а также для международного обмена генетическими ресурсами [9–10].

Целью данной работы является сохранение побегов барбариса in vitro при температуре +4 ºС (хла- дохранение), сохранение семян при температуре –20 ºС и –196 ºС.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись 66 образцов барбариса: барбарис амурский (B. amurensis), 19 форм барбариса илийского (B. iliensis), 27 форм барбариса цельнокрайнего (B. Integerrima), 2 формы барбариса продолговатого (B.Oblonga), барбарис сибирский (B.Sibirica), 15 форм барбариса круглоплодного (B.Sphaerocarpa) и барбарис Тунберга (B.Thunbergii). Данные по сбору растительного материала барбариса приведены в таблице 1.

Таблица 1

Образцы барбариса, место сбора, высота над уровнем моря

Для сохранения гермоплазмы барбариса использовали:

1. Семена, которые сохраняли при двух температурных режимах: а) –20 ºС — семена по 40–200 шт. запаковывали в пакеты из ламинированной фольги и закладывали на долгосрочное хранение в морозильную камеру; б) –196 ºС — семена по 20–100 шт. погружали в криопробирки и закладывали на долгосрочное хранение в Дьюары с жидким азотом в криогенный банк. Опыт проводили в 3 повторностях (n = 60). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по методике, описанной в пособии Г.Ф. Лакина и в программном пакете SYSTAT [12, 13].

2. Апикальные меристемы, изолированные из асептических побегов in vitro. Методика криоконсервации методом PVS2 витрификации подробно описана в статье Н.В. Ромадановой с соавтора-

ми [14]. Для криосохранения использовали 20 апексов побегов. Опыт проводили в 3 повторностях (n = 60), используя статистическую обработку экспериментальных данных [12, 13].

3. Хладохранение побегов in vitro барбариса. Среднесрочное сохранение побегов проводили в специализированных полиэтиленовых пакетах или культуральных сосудах при температуре 4 ºС, освещенность 10 µмол·м^-2·с^-1, фотопериод 16/8 ч на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС) с 20 г/л сахарозы, 0,8 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 0,02 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК), 1,75 г/л джелрайта, 4 г/л агара, рН 5,7.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате работ по введению в культуру in vitro и микроклональному размножению создана коллекция in vitro растений барбариса, состоящая из 41 образца [15-17] (рис. 1 А). Полученная коллекция in vitro заложена на среднесрочное хранение (хладохранение) при температуре 4 ºС, освещенность 10 µмол·м^-2·с^-1, фотопериод 16/8. Максимальная продолжительность хладохранения составляет 12 мес. (рис. 1 Б), после чего растения сдедует пересадить на свежие питательные среды.

Полученная коллекция in vitro также послужила основой для создания криобанка апикальных меристем барбариса при температуре -196 ºС. Методика криоконсервации для барбариса основана на методике, оптимизированной для яблони, и отличается небольшими модификациями [14, 18]. Процент регенерации меристем после криоконсервации составляет 60-80 %.

Для создания криобанка также использовали семена барбариса, которые заложили на долгосрочное хранение при температуре -20 ºС. Способность семян к прорастанию после хранения в течение 2 лет в среднем составляет 86,7 %. Лабораторная всхожесть семян барбариса круглоплодного сразу после сбора и после хранения в течение 2 лет при температуре -20 ºС показана на рисунке 2. Всхожесть семян после 2 лет хранения при пониженной температуре в среднем составляет 80,9 %, это практически соответствует проценту прорастания свежесобранных семян 81,0 % [15]. Статистически достоверной разницы в проценте всхожести между формами барбариса круглоплодного также не выявлено.

Семена 14 форм барбариса круглоплодного, 2 форм барбариса продолговатого, 1 формы барбариса сибирского и 1 формы барбариса Тунберга были заложены на долгосрочное хранение в криогенный банк при температуре –196 ºС. Всхожесть семян после размораживания колеблется в пределах 80–95 % (рис. 3, 4).

Процент прорастания семян барбариса круглоплодного после 2-летнего хранения при температуре –196 ºС в среднем составляет 84,4 %, что несколько выше процента прорастания свежесобранных семян 81,0 % [15]. В результате чего можно сделать вывод, что хранение при сверхнизкой температуре –196 ºС положительно сказывается на прорастании семян барбариса круглоплодного. Однако статистической разницы в проценте всхожести между формами барбариса круглоплодного не выявлено.

Также не замечено статистической разницы всхожести 2 форм барбариса продолговатого, барбариса сибирского и барбариса Тунберга сразу после сбора и после 2-летнего хранения при температуре –196 ºС. Однако всхожесть семян барбариса продолговатого формы 2, барбариса сибирского и барбариса Тунберга после 2-летнего хранения при температуре –196 ºС в среднем составляет 84,1 %, что значительно выше среднего процента всхожести семян сразу после сбора этих же образцов — 74,5 %.

В результате проведенной работы по созданию криобанка семян барбариса нами отмечено, что не выявлена статистически достоверная разница всхожести свежесобранных семян и семян после хранения при температурах —20 〇С и —196 〇С. Однако процент всхожести семян, хранившихся при низких температурах, несколько выше. Соответственно замораживание семян при низкой и сверхнизкой температурах является надежным способом для хранения генетического материала видов барбариса.

Заключение

Современный мир несет различные угрозы всем растениям, включая те, что крайне важны в качестве пищевых ресурсов. Данная работа посвящена актуальной теме — сохранению генетического материала ценных дикорастущих видов барбариса, в том числе и исчезающих видов, занесенных в Красную книгу. Созданный криобанк семян барбариса так же, как и любые другие генетические банки растений, позволит сохранить разнообразие растений, повысить вероятность восстановления культур после глобальных катастроф и предоставит важный источник материалов для ученых. Созданные коллекции образцов можно использовать для выведения более продуктивных культур и видов, стойких к болезнетворным организмам и изменениям климата.

Работа выполнена в рамках проекта 1783/ГФ4 — «Разработка технологии криогенного сохранения гермоплазмы ценных видов и форм барбариса — источника биологически активных веществ». По бюджетной программе 217 «Развитие науки», подпрограмме 102 «Грантовое финансирование научных исследований».

Список литературы

1. Флора Казахстана: в 9-ти т. — Т. 3 / под ред. Н.В. Павлова. — Алма-Ата: Изд-во АН КазССР, 1960. — 459 с.
2. Gaur P. In vitro radical scavenging activity and antimicrobial potential of Berberis asiatica Roxb. ex DC. fruit extracts in four different processed forms / P. Gaur, Sh. Bhatia, H.Ch. Andola, R.K. Gupta // Indian Journal of Traditional Knowledge. — 2017. — Vol. 16(4). — P. 706—713.
3. Sabir S. Phytochemical and antioxidant studies of Berberis lyceum / S. Sabir, K. Tahir, N. Rashid, S. Naz, B. Masood, M.A. Shah // Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences. — 2013. — Vol. 26 (6). — P. 72—78.
4. Abd E. In vitro biological assessment of Berberis vulgaris and its active constituent, berberine: antioxidants, antiacetylcholinesterase, anti-diabetic and anticancer effects / E. Abd, A.E. Wahab, D.A. Ghareeb, E.E. Sarhan, M.M. Abu-Serie, M.A. El Demellawy // BMC Complement Altern Med. — 2013. — Vol. 13(1), No. 218. — P. 13-18.
5. Sim0es Pires E.N. Berberine was neuroprotective against an in vitro model of brain ischemia: Survival and apoptosis pathways involved / E.N. Sim0es Pires, R.L. Frozza, J.B. Hoppe, M. Menezes Bde, C.G. Salbego // Brain Res. — 2014. — Vol. 1557. — P. 26— 33.
6. Hemmati М. Effects of an ethanolic extract of Berberis vulgaris fruits on hyperglycemia and related gene expression in strep- tozotocin-induced diabetic rats / М. Hemmati, Е. Serki, M.G. holami, R. Hoshyar // Clinical Phytoscience. — 2017. — Vol. 2(3). — P. 2—7.
7. Красная книга Казахстана. Т. 2. Растения. — 2-е изд. перераб. и доп. — Астана: ТОО АртГи^ХХ!, 2014. — 452 с.
8. Begenov A. Assessment of the Current Status of Populations of Kazakh Rare Plants (Berberis iliensis M. Pop.) / A. Begenov, N. Mukhitdinov, A. Ametov, S. Nazarbekova, A. Kuatbayev, B. Tynybekov, K. Abidkulova, A. Ydyrys // World Applied Sciences Journal. — 2014. — Vol. 30 (1). — P. 105–109.
9. Engelmann F. Use of biotechnologies for the conservation of plant biodiversity / F. Engelmann // In vitro Cellular & Developmental Biology — Plant. — 2011. — Vol. 47, No. 1. — P. 5–16.
10. Keller E.R.J. Cryopreservation for plant genebanks — a matter between high expectations and cautious reservation / E.R.J. Keller, A. Kaczmarczyk, A. Senula // CryoLetters. — 2008. — No. 1. — P. 53–62.
11. Lynch P.T. Climate change: the role of ex situ and cryo-conservation in the future security of economically important, vegetatively propagated plants / P.T. Lynch, E.E. Benson, K. Harding // J. Horticultural Science & Biotechnology. — 2007. — Vol. 82, No. 2. — P. 157–160.
12. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пос. для биол. спец. вузов / Г.Ф. Лакин. — 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Высш. шк., 1990. — 352 с.
13. SYSTAT (2007) SYSTAT 12.0, SYSTAT Software, Inc, San Jose, CA, pp. Statistics software.
14. Romadanova N. Development of a common PVS2 vitrification method for cryopreservation of several fruit / N. Romadanova, S. Kushnarenko, L. Karasholakova // In vitro Cellular & Developmental Biology. — 2017. — Vol. 53 (4). — Р. 382–393.
15. Ромаданова Н.В. Введение в культуру in vitro дикорастущих видов Berberis флоры Казахстана и Узбекистана / Н.В. Ро- маданова, С.А. Мишустина, Л.Н. Карашолакова, М.М. Аралбаева, Ф.Д. Кабулова, К.Т. Абидкулова, С.В. Кушнаренко // Вестн. Казахского нац. ун-та. Сер. биол. — 2015. — № 3 (65). — С. 346–354.
16. Ромаданова Н.В. Создание коллекции in vitro дикорастущих видов Berberis sp. / Н.В. Ромаданова, С.А. Мишустина, Л.Н. Карашолакова, М.М. Аралбаева, И.Р. Рахимбаев, С.В. Кушнаренко // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. — 2016. — № 121. — С. 69–76.
17. Ромаданова Н.В. Оптимизация микроклонального размножения барбариса / Н.В. Ромаданова, И.А. Махмутова, Л.Н. Карашолакова, А.А. Христенко, С.В. Кушнаренко // Биотехнология. Теория и практика. — 2017. — № 2. — С. 47–55.
18. Kushnarenko S. Cold acclimation improves regrowth of cryopreserved apple shoot tips / S. Kushnarenko, N. Romadanova, B. Reed // Cryo Letters. — 2009. — Vol. 30(1). — P. 47–54.