Исследование гипогликемических свойств ралейкина на модели аллоксанового диабета у крыс

Сахарный диабет (СД) занимает важное место в структуре смертности населения, а также среди причин нарушения трудоспособности и ухудшения качества жизни. Поэтому оптимизация терапии СД является одной из актуальных медицинских проблем. В статье приведены результаты экспериментального изучения гипогликемических свойств рекомбинантного антагониста рецепторов ИЛ-1 ралейкина, полученного в Санкт-Петербургском НИИ ОЧБП, на модели аллоксанового диабета у крыс. Доказано, что на модели аллоксанового диабета у крыс антагонист рецепторов интерлейкина-1 проявляет гипогликемическое действие, по выраженности которого не уступает анакинра и превосходит метформин. Можно предположить, что гипогликемическое действие ралейкина является результатом не только блокады рецепторов интерлейкина-1 в поджелудочной железе и последующей защиты ß-клеток от повреждающего действия аллоксана, но также связано со способностью препарата тормозить образование продуктов неферментативного гликозилирования и подавлять развитие воспалительных процессов в ß- клетках. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности дальнейшего экспериментального изучения антидиабетических свойств ралейкина с целью последующего включения препарата в комплексную терапию СД I типа.

Сахарный диабет (СД) занимает важное место в структуре смертности населения, а также среди причин нарушения трудоспособности и ухудшения качества жизни [1, 6]. По данным Международной федерации диабета в 2011 году количество больных СД в мире достигло 366 млн, а в 2030 году составит 552 млн [2, 8]. Поэтому оптимизация терапии СД является одной из актуальных медицинских проблем. Сегодня известно много причин, способных вызвать это заболевание, а именно, генетические или метаболические нарушения, неправильное питание, гиподинамия, стрессы, интоксикации, осложнения в результате применения некоторых лекарственных препаратов и др. [1, 10]. Одним из пусковых моментов развития СД является также увеличение продукции свободных радикалов [7, 13].

Следовательно, СД является полиэтиологическим заболеванием, что доказывает целесообразность использования комплексной терапии. Особого внимания заслуживают антидиабетические препараты с комплексной фармакодинамикой, которые наряду с гипогликемическим действием обладают антиоксидантным эффектом и способны сохранять и улучать секреторную функцию ß- клеток [7, 10].

В основе патогенеза наиболее серьезных осложнений СД (тромбозы, атеросклероз, почечная недостаточность, катаракта и др.) лежат процессы неферментативного гликозилирования. Образование продуктов гликозилирования начинается с формирования ковалентной связи между альдегидной группой молекулы глюкозы и реактивной аминогруппой протеинов, локализованной на N-конце лизинового фрагмента, и заканчивается образованием гликозилированного гемоглобина (HbAic) [1, 9]. Неферментативное присоединение глюкозы к белку приводит к необратимым метаболическим нарушениям [1].

Учитывая наличие у рекомбинантного антагониста рецепторов интерлейкина-1 (ИЛ-1) антиоксидантных свойств [12], а также доказанного гипогликемического действия и влияния на начальные реакции неферментативного гликозилирования на модели дитизонового диабета у кролей, представляло интерес выяснить его влияние на развитие аллоксанового диабета у крыс.

Целью данной работы стало экспериментальное изучение гипогликемических свойств рекомбинантного антагониста рецепторов ИЛ-1 ралейкина, полученного в Санкт-Петербургском НИИ ОЧБП (Россия), на модели аллоксанового диабета у крыс.

Материалы и методы. Абсолютную инсулиновую недостаточность прямого ß-цитотоксического Генеза вызывали с помощью одноразового подкожного введения аллоксана в дозе 20 мг на 100 г массы тела белым беспородным самкам крыс весом 160-220 г, которых предварительно сутки держали на голодной диете [3].

В качестве препаратов сравнения использовали синтетический гипогликемический препарат метформин, который входит в стандарты лечения СД обоих типов, и анакинра, рекомбинантный антагонист рецепторов ИЛ-1 с доказанной гипогликемической активностью, который является структурным аналогом исследуемого препарата [12]. Препараты вводили в лечебном режиме один раз в сутки в течение 10 суток, начиная с 4 дня после воспроизведения модельной патологии: ралейкин в дозе 7 мг/кг и анакинра в дозе 8 мг/кг - подкожно [12], метформин в дозе 30 мг/кг - внутрижелудочно [7, 5].

Гипогликемическое действие исследуемых препаратов оценивали по следующим показателям: выживаемость животных и базальная гликемия в сыворотке крови в динамике через 3 часа, на 3 и 14 сутки после введения аллоксана; уровень гемоглобина (Hb), HbAic и С-реактивного белка (С-РБ) в сыворотке крови на 14 сутки исследования. Содержание глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозооксидазным методом при помощи ферментативного анализатора глюкозы «Эксан-Г» (Литва), уровень Hb - унифицированным гемоглобинцианидным методом, уровень HbA1c - колориметрическим методом по реакции с тиобарбитуровой кислотой, содержание С-РБ - иммунотурбидиметрическим методом при помощи тест- наборов фирмы «Lachema» [4].

В случае учета результатов в виде средняя ± стандартная ошибка статистическую достоверность внутригрупповых различий оценивали по критерию Вилкоксона, межгрупповых - по t критерию Стьюдента с поправкой Бонферони.

Результаты и их обсуждение. Результаты исследований приведены в Таблица 1-3 и позволяют рассматривать модель аллоксанового диабета как приближенную к СД 1 типа у человека [7]. Несмотря на отсутствие аутоиммунной составляющей в механизмах аллоксанового диабета, токсическое действие аллоксана модулирует события, подобные аутоиммунному повреждению ß-клеток поджелудочной железы в условиях СД 1 типа, а именно, свободнорадикальные повреждения, модификацию белков и нуклеиновых кислот, индукцию апоптоза [3, 7].

Аллоксан представляет собой нестабильный пиримидин (2,4,5,6-тетраоксогексагидропиримидин), обладающий выраженным диабетогенным действием. После введения в организм аллоксан связывается с мембранами панкреатических ß-клеток, что приводит к быстрому снижению секреции инсулина. Токсический эффект аллоксана проявляется в течение первых минут после введения, выраженная инсулиновая недостаточность - через несколько суток. Известно, что развитие аллоксанового диабета у животных происходит при участии активных форм кислорода и сопровождается апоптозом [3].

Как свидетельствуют данные табл. 1, развитие аллоксанового диабета привело к гибели части экспериментальных животных. Через 3 часа и 3 суток после введения диабетогенного вещества экспериментальные животные во всех группах были живы. На 14 сутки эксперимента в группах контрольной патологии и получающих анакинра погибло по 3 животных из 8 (выживаемость составила 62,5%). В группах животных, которым вводили ралейкин и метформин, выжило 6 крыс из 8 (выживаемость составила 75%).

Одним из главных признаков СД является уровень глюкозы в крови (базальная гликемия). Так, содержание глюкозы в сыворотке крови животных группы контрольной патологии через 3 ч после введения аллоксана достоверно увеличилось в 1,7 раза, через 3 суток - в 1,9 раза, через 14 суток -в 2,3 раза относительно показателей группы интактного контроля (Таблица 2).

Использование всех исследуемых препаратов способствовало достоверному снижению уровня базальной гликемии в сыворотке крови экспериментальных животных. Так, на фоне ралейкина на 14 сутки эксперимента содержание глюкозы в сыворотке крови животных достоверно снизилось в 2 раза относительно показателя в группе контрольной патологии, хотя при этом достоверно (в 1,2 раза) превышало соответствующий показатель в группе интактного контроля.

Таблица 1 - Влияние ралейкина на динамику выживаемости животных на модели аллоксанового диабета у крыс (п =8)

Примечание: Статистически значимые различия (р ≤ 0,05): * - к группе интактного контроля; ** - к группе контрольной патологи; n – количество животных в группе.

Под действием метформина на 14 сутки исследования базальная гликемия была достоверно в 1,4 раза ниже, чем гликемия в крови животных группы контрольной патологии, но достоверно превышала (в 1,4 раза) гликемию в группе животных интактного контроля. На фоне введения анакинра содержание глюкозы в сыворотке крови крыс на 14 сутки эксперимента было достоверно ниже в 2 раза, чем в группе контрольной патологии и достоверно не отличалось от показателя в группе интактного контроля. Гипогликемическое действие метформина достоверно уступало активности анакинра и ралейкина. Достоверных отличий в уровне базальной гликемии в группах анакинра и ралейкина, не зафиксировано.

Таблица 2 - Влияние ралейкина на динамику базальной гликемии на модели аллоксанового диабета у крыс

Примечание: Статистически значимые различия (р ≤ 0,05): * - к группе интактного контроля; ** - к группе контрольной патологи; # - к группе метформина; n – количество животных в группе.

Развитие модельного диабета сопровождалось активацией начальних реакций неферментативного гликозилирования. Так, на 14 сутки исследования процентное содержание HbA1c в сыворотке крови животных группы контрольной патологии достоверно увеличилось в 1,7 раза, при этом соответственно содержание Hb достоверно уменьшилось в 1,3 раза относительно соответствующего показателя в группе животных интактного контроля (Таблица 3).

Под действием ралейкина содержание Hb в сыворотке крови крыс достоверно возросло в 1,3 раза, содержание HbA1c - достоверно снизилось в 1,5 раза по сравнению с показателями группы контрольной патологии и достоверно не отличалось от показателей группы интактного контроля. На фоне метформина содержание Hb в сыворотке крови экспериментальных животных достоверно возросло в 1,1 раза, содержание HbA1c - достоверно снизилось в 1,2 раза по сравнению с показателями в крови животных группы контрольной патологии. При этом указанные показатели достоверно отличались от соответствующих показателей в группе интактного контроля. Полученные результаты являются подтверждением данных литературы про способность метофрмина тормозить нефрементативное гликозилирование при СД [9].

Таблица 3 - Влияние ралейкина на концентрацию продуктов неферментативного гликозилирования и уровень С-реактивного
белка в сыворотке крови на модели аллоксанового диабета у крыс (14 сутки)

Примечание: Статистически значимые различия (р ≤ 0,05): * - к группе интактного контроля; ** - к группе контрольной патологии; # - к группе метформина; n – количество животных в группе.

Введение анакинра способствовало достоверному повышению содержания Hb в сыворотке крови животных в 1,2 раза, снижению уровня HbA1c - в 1,4 раза относительно показателей группы контрольной патологии. Данные показатели достоверно не отличались от соответствующих показателей группы интактного контроля. По нормализующему влиянию на содержание Hb и HbA1c в сыворотке крови экспериментальных животных ралейкин и анакинра достоверно не отличались друг от друга. При этом оба препарата достоверно превосходили действие метформина на неферментативное гликозилирование.

Подтверждением того, что одним из патогенетических звеньев инсулинзависимого диабета является воспаление [1, 8, 11], служит достоверное повышение в сыворотке крови экспериментальных животных с аллоксановым диабетом содержания одного из известных маркеров воспаления - С- РБ в 3,9 раза по сравнению с показателем группы интактного контроля. Под действием ралейкина уровень С- РБ в сыворотке крови крыс достоверно снизился в 1,9 раза по сравнению с аналогичным показателем в группе контрольной патологии, под действием метформина - в 1,5 раза, на фоне анакинра - в 1,7 раза. То есть, все исследуемые препараты снижали выраженность воспалительных процессов при модельном диабете, однако по нормализующему влиянию на содержание С-РБ в сыворотке крови крыс ралейкин и анакинра превосходили метформин. 

Выводы. Таким образом, на модели аллоксанового диабета у крыс оригинальный рекомбинантный антагонист рецепторов интерлейкина-1 проявляет гипогликемическое действие, по выраженности которого не уступает анакинра и превосходит метформин. Можно предположить, что гипогликемическое действие ралейкина является результатом не только блокады рецепторов интерлейкина-1 в поджелудочной железе и последующей защиты ß-клеток от повреждающего действия аллоксана, но также связано со способностью препарата тормозить образование продуктов неферментативного гликозилирования и подавлять развитие воспалительных процессов в ß-клетках. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности дальнейшего экспериментального изучения антидиабетических свойств ралейкина с целью последующего включения препарата в комплексную терапию СД I типа.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балаболкин М.И. Лечение сахарного диабета и его осложнений. - М.: 2005. - 512 с.
2. Дедов И.И. Сахарный диабет - опаснейший вызов мировому сообществу // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2012. - №1. - С. 7-13.
3. О.В. Стефанова Доклінічні дослідження лікарських засобів. - К.: Авіценна, 2001. - 528 с.
4. Камышников В.С. Справочник по клиническо-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. - Минск: «Беларусь», 2002. - Т.1. - 495 с. - Т.2. - 463 с.
5. Полторак, В.В. Стандарт современных пероральных антидиабетических препаратов // Medicus Amicus. - 2005. - № 5. - С. 16.
6. Тронько, М. Д. Поширеність цукрового діабету в областях Украïни за 2008 рік // Основні показники діяльності ендокринологɪчноï служби Украïни за 2008 рік. - К.: АМНУ, МОЗУ, 2009. - С. 18.
7. Шумейко О. Г. Експериментальне обïрунтування застосування екстракту з мíдɪï чорноморськоï (Mytilus galloprovincialis Lam.) у комплексны терапɪï цукрового дɪабету : Дис канд. мед. Наук - Х., 2009. - 153 с.
8. Ю.И. Сунцов, Л.Л. Болотская, О.В. Маслова и др. Эпидемиология сахарного диабета и прогноз его распространенности // Сахарный диабет. - 2011. - №1. - С. 15-18.
9. Beisswenger P. Metformin inhibition of glycation processes // Diabetes. Metabol. - 2003. - Vol. 29. - № 4. - P. 95-103.
10. B0rjesson A. Altered proinsulin conversion in rat pancreatic islets exposed long-term to various glucose concentrations or interleukin- 1beta // J Endocrinol. - 2007. - Vol. 192 (2). - P. 381-387.
11. T. Mandrup-Poulsen, K. Bendtzen, C.A. Dinarello et al. Human tumor necrosis factor potentiates human interleukin 1-mediated rat pancreatic beta-cell cytotoxicity / // J Immunol. - 1987. - Vol. 139 (12). - P. 4077-4082.
12. J.O. Sandgerg, A. Andersson, D.L. Eizirik et al. Interleukin-1 receptor antagonist prevents low dose streptozotocin induced diabetes in rats // Biochem Biophys Res Commun. - 1994. - Vol. 202 (1). - P. 543-548.
13. C. Lagathu, L. Yvan-Charvet, J.P. Bastard, et al. Long-term treatment with interleukin-1β induces insulin resistance in murine and human adipocytes // Diabetologia. - 2006. - № 49. - Р. 2162-2173.