В данной статье приведена актуальность использования инулина в современной медицине. Из перечисленных методов определения количественного содержания полифруктозана описывается методика, основанная на кислотном гидролизе инулина с соляной кислотой на водяной бане с образованием продукта трансформации фруктозы – 5-гидроксиметилфурфурола с дальнейшим спектрофотометрическим определением. Проведена оценка основных метрологических характеристик методики спектрофотометрического количественного определения методом удельного показателя поглощения.
Актуальность проблемы
На сегодняшнее время широкого распространения среди населения всего мира занимают такие заболевания, как сахарный диабет, атеросклероз, алиментарное ожирение. Для профилактики и лечения данных заболеваний в медицине активно используют углеводные полимеры - полифруктаны, в частности инулин [1]. Кроме влияния на обмен веществ, он способствует выведению из организма солей тяжелых металлов, принимает участие в усвоении кальция, железа. По данным некоторых источников, у ү-инулина были выявлены также иммуномодулирующие свойства [2].
Введение
Инулин - резервный полисахарид некоторых видов растений и бактерий [3]. Он представляет собой смесь олиго- и полисахаридов фруктозана. Растительный инулин характеризуется средней степенью полимеризации, и, как правило, состоит из 10-60 молекул фруктозы и одной терминальной молекулы глюкозы [4].
В настоящее время ни один из существующих методов анализа не позволяет определить достоверный качественный состав всех компонентов инулина. Необходима комбинация различных методов исследования для установления структуры нативного инулина. С этой целью широко используются совокупность таких методов анализа, как высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия, высокоэффективная анионообменная хроматография с импульсным амперометрическим детектированием. Для рутинного анализа и количественной оценки содержания инулина в лекарственном растительном сырье (ЛРС) широко используют метод спектрофотомерии в разных вариантах: метод стандарта, удельного показателя поглощения и фотоколориметрирования окрашенных продуктов реакции инулина с различными реагентами [7, 8].
Целью нашей работы является оценка метрологических характеристик методики количественного определения инулина методом прямой спектрофотомерии для установления её возможности использования при анализе вытяжек из ЛРС.
При анализе в сложных природных матрицах наиболее применяемыми методами количественной оценки содержания инулина являются ферментативный и кислотный способы его гидролиза с образованием фруктозы и количественное определение последней [9]. Определению не мешают присутствующие в смеси другие полисахариды, типа амилозы, маннанов, ксиланов или арабинанов [10].
Материалы и методы
Экспериментальные исследования проводили с использованием субстанции инулина № A18425 (количественное содержание 98%) номер партии H5597. Спектрофотометрические определения проводили на спектрофотометре Specord 200. В ходе работы использовали весы аналитические АВ 204 S/A Mettler Toledo, мерную посуду класса А, реактивы, которые отвечают требованиям Государственной Фармакопеи Украины.
Для анализа была выбрана методика количественного определения инулина, основанная на его способности при нагревании с 5% раствором хлористоводородной кислоты в течение 2,5 ч образовывать продукт трансформации фруктозы - 5- гидроксиметилфурфурол, который имеет максимум поглощения в области 285 нм (рисунок 1).
Расчет содержания суммы фруктозанов проводили с использованием удельного показателя поглощения 5-гидроксиметилфурфурола, который равен 298 [7]. Поскольку отечественная нормативная документация на субстанцию инулина отсутствует, с целью оценки результатов количественного определения инулина использовали зарубежный стандарт Official Monographs “Inulin” (The US Pharmacopoeia, XXII), согласно которому содержание фруктозы в инулине должно быть не менее 94% и не более 102%, рассчитанного на сухой препарат. Таким образом, при расчете критериев валидационных характеристик методики анализа использовали регламентированное АНД содержание и допуски содержания 98±4,0%.
Основной целью валидации аналитической методики является доказательство на основе экспериментальных данных того, что методика пригодна или непригодна для решения предполагаемых задач. Валидация методики обязательно предполагает оценку полученных валидационных характеристик по отношению к критериям приемлемости. Поэтому нами были рассчитаны критерии приемлемости с учетом регламентируемых допусков содержания инулина в субстанции и особенностей метода спектрофотометрии в варианте показателя поглощения (таблица 1) [11,12].
Таблица 1 - Критические значения систематической погрешности (max δtot), полной неопределенности анализа (тах∆⑆ś) и параметров линейной зависимости Yi = b^Xi + a для тестируемой методики*
g = 5 точек, допуск содержания 94-102% (В=±4,0%), диапазон применения 80-120%.
субстанция |
λ нм |
A1% A1cm |
Спотмг / 100мл |
Аном |
maxΔAs % |
maxδtot = maxΔprec% |
RSDo % |
min R2c |
maxa % |
maxδ А% |
Инулин |
285 |
298 |
1,960 |
0,584 |
4.0 |
2.84 ¯¯ |
1.2 |
0.9964 ¯¯ |
5.5 |
2,42 |
Поскольку процедура пробоподготовки включает проведение кислотного гидролиза инулина с образованием 5-гидроксиметилфурфурола, необходимо было определить оптимальное время спектрофотометрирования исследуемого раствора.
Исследование стабильности исследуемого раствора проводили на протяжении часа, определяя через каждые 15 минут оптическую плотность раствора (таблица 2).
Таблица 2 - Результаты исследования стабильности исследуемого раствора
Исследуемый раствор |
Время исследования стабильности nt, мин. |
Cr,t |
Sr,t |
RSDt, % |
Δt% |
maxδt 〇ţ |
||||
0 |
15 |
30 |
45 |
60 |
||||||
А |
0,9313 |
0,9272 |
0,9230 |
0,9259 |
0,9267 |
77,75 |
0,28 |
0,36 |
0.78 |
2.8 |
0,9313 |
0,9269 |
0,9214 |
0,9267 |
0,9279 |
||||||
0,9313 |
0,9271 |
0,9212 |
0,9261 |
0,9279 |
||||||
Аср. |
0,9313 |
0,9271 |
0,9219 |
0,9262 |
0,9275 |
|||||
χ _А · 100 · 25 Х ¯ 298 · 0,1 · 1 ,% |
78,13 |
77,77 |
77,34 |
77,70 |
77,81 |
Обсуждение результатов
В ходе эксперимента было установлено, что неопределенность оптической плотности аналитического раствора составляет Δt=0,78%, и значимо не влияет на результаты анализа (Δt=0,78%≤2,8%=maxδtot). Определение лучше проводить через 30 минут после получения растворов.
Определение параметров линейности методики проводили в диапазоне концентраций от 3.2∙10-5 до 4.8∙10-5 г/мл согласно стандартизованyой процедуре [13]. Линейная зависимость описывается уравнением Y=0,7581x+0,0002 и характеризуется величинами sb=0,018, sa=0,0007, sr=0,0002≤1,00=RSD0, sr/b=0,0003 (отношение остаточного стандартного отклонения прямой к угловому коэффициенту), r2=0,9983≥0,9848=Rc (коэффициент корреляции) (Рисунок 2). График линейной зависимости при
Таблица 3 - Результаты статистической оценки метрологических характеристик методики количественного определения инулина методом спектрофотомерии
№ раствора |
Введено в % к концентрации раствора сравнения Xi =(Ci /Cnom)∙100% |
Найдено в % к концентрации раствора сравнения Yi =(Ai* /Anom)∙100% |
Найдено в % к введенному Z = (Yi/Xi)100% |
1 |
80,00 ¯¯ |
61,10 |
76,38 |
2 |
90,00 |
68,40 |
76,00 |
3 |
100,00 |
78,13 |
78,13 |
4 |
110,00 |
84,04 |
76,40 |
5 |
120,00 |
93,34 |
77,79 |
Среднее, Х% |
76,94 |
||
Относительное стандартное отклонение, RSDx% |
0,89 |
||
Относительный доверительный интервал ‰гедº/о = ţ[95Ď/6,4)·ŔŚРх = 2.13∙RSDx |
1.90 |
||
Критическое значение сходимости результатов ®ргед≤ 2.8% |
Соотв. |
||
Систематическая погрешность M- ∣X- 100 ∣ ~~ |
21.06 |
||
Критерий приемлемости систематической погрешности [?][?][?][?][?]< ⅞[?]Ell?]= 0.63/3 = 0.21 ΞΞ если не выполняется 1), то 2) ĒĒ] ≤ шɑхĒŕоŕĒ][?][?][?][?] |
Не соотв. |
||
Вывод о методике |
Не корректна |
Выводы
В ходе проверки метрологических показателей при количественном определении инулина, пришли к выводу, что приведенная методика не корректна, имеет большое значение погрешности. Согласно методике, содержание инулина в пересчете на фруктозу составляет 76,94 %, стандартное отклонение - 0,89 % и относительный доверительный интервал - 1,90 %.
Заниженные результаты анализа инулинового порошка, на наш взгляд, можно пояснить побочными процессами образования гуминовых веществ, а также регидратацией 5-гидроксиметилфурфурола в левулиновую и муравьиную кислоты, которые относятся к весьма слабо поглощающим соединениям в ультрафиолетовой области спектра (и то лишь в коротковолновой области, менее 200 нм). В ходе исследования мы также пришли к выводу, что на эффективность получения 5- гидроксиметилфурфурола существенное влияние оказывает также температура и время проведения кислотного гидролиза, активность воды и концентрация инулина.
Однако, не смотря на заниженные результаты эксперимента, приведенная методика удобна в использовании при рутинном анализе, т.к. расчет производится не по методу стандарта (стандарты инулина различны в зависимости от источника получения), а методом удельного показателя поглощения. К тому же, методика предусматривает пересчет основного вещества на фруктозу, которая представляется собой соединение с фиксированным составом.
Для использования анализируемой методики в рутинном анализе необходима оптимизация условий проведения эксперимента (в частности времени гидролиза) с целью повышения точности и/или же введение коэффициента пересчета (для учета потери вещества при гидролизе).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Campbell R.K. Type II diabetes mellitus: disease state management // Retail Pharmacy News. - 2009. - Vol. 9. - P. 12-15.
- Erdei A. Enhancement of the immune respone by γ-inulin // Abstr. IX Seminar on Inulin. Hungary. - 2002. - Р. 10-11.
- Отт В.Д. Роль пребіотиків в дитячому харчуванні / В.Д. Отт, О.М. Муквіч // Проблеми харчування. - 2005. - № 5. - С. 2-5.
- Городецкий Г.Б. Получение инулина и других фруктанов из инулинсодержащего сырья / Г.Б. Городецкий, Л.А. Аравина, Н.Я. Иванова // Раст. ресурсы. - 2001. - Т. 15, № 3. - С. 5-9.
- Руководство по методам контроля качества и безопасности БАД к пище. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 240 с.
- Quemener B., Thibault J.F. and Coussement P. Determination of inulin and oligofructose in food products and integration in the AOAC method for the measurement of total dietary fibre // Lebensmitt. Wissench Technol. - 1994. - Vol. 27. - Р. 125-132.
- Ананьина Н.А. Стандартизация инулина, полученного из клубней георгины простой. Изучение некоторых физико-химических свойств инулина / Н.А. Ананьина, О.А. Андреева, Л.П. Мыкоц, Э.Т. Оганесян // Химико-фармац. Журнал. - 2009. - Т. 43. - №3. - С. 35-37.
- Оленников Д.Н. Исследование колориметрической реакции инулина с резорцином в зависимости от условий ее проведения / Д.Н. Оленников, Л.М. Танхаева // Химия раст. сырья. - 2008. - № 1. - С.87-93.
- Official Monographs “Inulin” The US Pharmacopoeia, XXII.
- Simonovska B. Determination of inulin in foods // Journal of AOAC International. - 2000. - № 83(3). - Р. 675-678.
- Стандартизованная процедура валидации спектрофотометрических методик количественного определения лекарственных средств в варианте метода показателя поглощения. Сообщение 1 / А.И. Гризодуб, О.А. Евтифеева, К.И. Проскурина, Е.В. Безумова // Фармаком. - 2014. - № 1. - С. 29-39.
- Стандартизованная процедура валидации спектрофотометрических методик количественного определения лекарственных средств в варианте метода показателя поглощения. Сообщение 2 / А.И. Гризодуб, О.А. Евтифеева, К.И. Проскурина, Е.В. Безумова // Фармаком. - 2014. - № 2. - С. 45-54.
- Евтифеева О.А. Стандартизованная процедура валидации методик количественного определения экстемпоральных лекарственных средств в условиях аптек и лабораторий по контролю качества / О. А. Евтифеева,
- В. А. Георгиянц // Фармаком. - 2007. - № 1. - С. 69-81.