Циркуляция вирусов гриппа в Аральском регионе республики Казахстан в эпидемический сезон 2015 г.

В январе – марте 2015 г. в лечебных учреждениях Актюбинской и Кызылординской областей от больных людей с диагнозами ОРВИ, ринофарингит и аденовирусная инфекция собрано 293 носоглоточных смыва и 48 сывороток крови.

В полимеразной цепной реакции генетический материал вируса гриппа А был обнаружен в 12,6% случаев, вируса гриппа B – в 1,0%. При субтипировании РНК вируса гриппа A/H3N2 идентифицирована в 9,2% проб, A/H1N1 – в 2,7%, в 0,7% проб РНК одновременно выявлена к обоим подтипам вирусов гриппа A(H1N1+H3N2). Результаты, полученные при скрининге носоглоточных смывов в ПЦР, также как и данные серологических исследований в реакции торможения гемагглютинации и иммунноферментном анализе, представленные в статье, свидетельствуют о социркуляции на территории Аральского региона вирусов гриппа A/H3N2, А/H1N1 и B. В работе приводятся сведения по изоляции вирусов гриппа А/H1N1 от больных людей на культуре клеток MDCK и развивающихся куриных эмбрионах.

ВВЕДЕНИЕ.

Острые респираторные вирусные инфекции и грипп являются самыми массовыми инфекциями человечества и представляют серьезную проблему для общественного здравоохранения. По социальной значимости, огромному ущербу наносимому здоровью населения и экономике, грипп находится на первом месте среди всех заболеваний человека. На долю гриппа и ОРЗ приходится 10 — 30% временной нетрудоспособности населения. Обычно грипп и ОРЗ составляют до 40% всех заболеваний взрослых, более 80% всей инфекционной патологии, более 60% заболеваний среди детей. Смертность от гриппа в разных странах колеблется от 2 до 80 случаев на 100 000 населения [1, 2].

Заболевания гриппом регистрируются постоянно в течение всего года в крупных городах и промышленных регионах, спорадическая заболеваемость не прекращается даже в летние месяцы, тем самым обеспечивая непрерывность эпидемического процесса гриппозной инфекции [3].

Спектр эпидемических штаммов вирусов гриппа и их характеристика варьируют в зависимости от сезонов года. В последнее время в мире, в том числе и в различных регионах Казахстана наблюдается одновременная циркуляция вирусов гриппа подтипов A(H1N1), A(H3N2) и рода B [4, 5, 6]. Кроме того, необычайная сложность эпидемической ситуации связана с появлением реассортантных вирусов [7, 8].

Целью настоящего исследования являлось изучение особенностей циркуляции вирусов гриппа в Аральском регионе Казахстана в эпидемический сезон 2015 г.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Сбор клинических образцов (назофарингеальные смывы, сыворотки крови) от больных осуществляли в лечебных учреждениях в эпидемический период 2015 г. Пробы до вирусологических исследований хранили в жидком азоте.

Первичный скрининг носоглоточных смывов в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (РТ-ПЦР) осуществляли на амплификаторе RotorGen 6000 (CorbettResearch, Австралия) с применением наборов "РИБО – преп", "АмплиСенс® Influenzavirus A/B-FL" и "АмплиСенс ® Influenzavirus A-тип -FL" (производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, РФ) [9].

Изоляцию вирусов проводили в двух системах традиционными методами: на культуре клеток МДСК с добавлением ТРСК - трипсина (2 мкг/мл) и 9-11-дневных куриных эмбрионах (КЭ). Для индикации вируса в реакции гемагглютинации (РГА) использовали 0,75% взвесь эритроцитов петуха и человека 0(1) группы крови.

Инфекционную активность изолятов определяли по общепринятому методу [10] и их титр выражали в lg ЭИД50/0.2мл и lgТЦИД50/0.2мл.

Идентификацию изолятов проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции ингибиции нейраминидазной активности (РИНА) с наборами поликлональных диагностических сывороток согласно рекомендации ВОЗ [11, 12].

Уровень специфических антител к вирусам гриппа в сыворотках крови определяли в РТГА и иммуноферментном анализе (ИФА). РТГА проводили согласно рекомендации ВОЗ с использованием как эталонных вирусов: A/California/04/09 (H1N1), A/New Jersey/8/76(H1N1), A/Wisconsin/67/05 (H3N2), B/Shandong/07/07, так и коммерческих диагностикумов производства ФГБУ НИИ гриппа (г.Санкт-Петербург). Для ИФА использовали тест- системы производства ООО «ППДП» (г. Санкт-Петербург) к вирусам гриппа подтипов А(H1N1), А(H3N2) и типа В.

Результаты и обсуждение.

Сбор материалов проводили в эпидемический сезон (январь – март 2015 г.) в поликлиниках и инфекционных больницах Актюбинской и Кызылординской областей. Всего от больных людей было собрано 293 смыва из верхних дыхательных путей и 48 сывороток крови.

Процентное соотношение собранных образцов в зависимости от диагноза составило: «ОРВИ» - 97,27% (285 образцов) от общего числа смывов, «ринофарингит» – 2,04% (шесть проб) и «аденовирусная инфекция» – 0,68% (2 образца). Наибольшее количество носоглоточных смывов получено от детей до 14 лет (67,1%).

Результаты первичного скрининга носоглоточных смывов в РТ-ПЦР представлены на рисунке 1.

Таблица 1 - Гемагглютинирующая и инфекционная активность казахстанских изолятов вирусов гриппа, выделенных на куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

Как видно из рисунка 1, при исследовании 293 проб генетический материал вируса гриппа был обнаружен в 13,6 % случаев от общего числа проб (40 образцов). РНК вируса гриппа A выявлена в 12,6% (37 проб), вируса гриппа B - в 1,0% (три образца). Субтипирование позволило обнаружить РНК вируса гриппа A/H1N1 в 2,7% случаев (восемь смывов), в 9,2% (27 смывов) обнаружена РНК вируса A/H3N2, в двух пробах (0,7%) выявлена РНК одновременно к обоим подтипам вирусов гриппа A(H1N1+H3N2).

Таким образом, первичный скрининг носоглоточных смывов в РТ-ПЦР показал, что в Актюбинской и Кызылординской областях циркулируют вирусы гриппа подтипов А/H1N1, A/H3N2 и типа B.

В результате первичного заражения КЭ и культуры клеток MDCK 293 пробами и проведения последующих пассажей выделено восемь гемагглютинирующих агентов (ГАА) (таблица 1).

Как видно из таблицы 1, наименьшей инфекционной активностью обладал изолят 58/15 (2,33 lg ЭИД50/0,2мл и 1,23 lgТЦИД50/0.2мл), наибольшей - 06/15 (8,77 lgЭИД50/0,2мл и 6,33 lgТЦИД50/0.2мл). Для дальнейшей работы отобрано пять актюбинских изолятов (2/15, 3/15, 6/15, 18/15 и 20/15) с более высокими гемагглютинирующими титрами.

При определении подтипа гемагглютинина в РТГА установлено, что гемагглютинирующая активность всех изолятов от ¼ до 1/32 гомологичных титров подавлялась иммунными сыворотками к вирусам A/США/1976/31 (H1N1), А/Соломоновы Острова/03/06 и А/Калифорния/04/09 (H1N1)pdm. Это позволило отнести ГАА к вирусу гриппа А с подтипом гемагглютинина Н1 (таблица 2).

Таблица 2 - Идентификация подтипа гемагглютинина актюбинских изолятов вирусов гриппа 2015 г. выделения в РТГА

Примечание - приведены обратные величины титров специфических антигемагглютининов изолятов вируса гриппа А в РИНА представлены в таблице 3.

Результаты идентификации подтипа второго поверхностного гликопротеида

Таблица 3 - Идентификация подтипа нейраминидазы актюбинских изолятов вируса гриппа 2015 г. выделения в РИНА

Из таблицы 3 видно, что нейраминидазная активность всех изолятов в титрах 1:100 подавлялась иммунной поликлональной сывороткой к Н1N1.

Таким образом, по результатам РТГА и РИНА изоляты А/Актобе/02/15, А/Актобе/03/15, А/Актобе/06/15,

А/Актобе/18/15 и А/Актобе/20/15 отнесены к вирусу гриппа А с антигенной формулой Н1N1.

Для изучения сероэпидемиологической ситуации по гриппу в Аральском регионе в 2015г. исследовано 48 сывороток крови в РТГА и ИФА. Результаты РТГА приведены на рисунке 2.

Как видно из рисунка 2, в 60,4% случаев в сыворотках крови людей обнаружены антигемагглютинины к вирусу гриппа A/H3N2. Титры антител составили 1:40 - 1:640.

Серопозитивными по отношению к вирусу гриппа А/H1N1 оказались 10,5% сывороток с титрами антител 1:80 - 1:320. В 6,3% случаев сыворотки были положительными по отношению к вирусу гриппа B, в 2,1% сывороток выявлены антигемагглютинины одновременно к вирусам гриппа А/H3N2 и В, в 4,2% - к А/H1N1 и A/H3N2.

Серологическое исследование 48 сыворотках крови, проведенное в ИФА показало наличие антител к вирусу гриппа A/H3N2 в 69,6% случаев, к A/H1N1 - в 12,6% и к вирусу гриппа В - в 4,2% сывороток (рисунок 3).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате первичного скрининга в РТ-ПЦР носоглоточных смывов и серологических исследований сывороток крови, собранных в эпидемический сезон 2015 г. от больных людей в Актюбинской и Кызылординской областях РК, выявлена социркуляция вирусов гриппа A/H3N2, А/H1N1 и B. Циркуляция вируса гриппа с антигенной формулой А/H1N1 подтверждена выделением из клинических образцов пяти изолятов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Салтыкова Т.С. Отсроченная смертность при гриппе среди лиц пожилого возраста// ЖМЭИ. - 2010. - №4. - С. 8-13.
2. Социальное значение эпидемий гриппа [Электронный ресурс]. Дата обновления: 16.11.15. — URL: http://www.vitaminov.net/rus-gripp-epydem-0-20371.html (дата обращения: 16.11.15).
3. Карпухин Г.И. Грипп. – Л.: Медицина. - 1986. – С. 348.
4. Klivleyeva N.G., Glebova T.I., Lukmanova G.V., Bayseit S.B., Taubaeva Sh.Zh., Kalkozhaeva M.K. Influenza virus circulation among the population of Kazakhstan in 2012-2014 // 17th International Conference on Virology and Infection Diseases. World Academy of Science, Engineering and Technology, International Science Index, Medical and Health Sciences, 2(9), 1030. – London: 2015.- 2(9).- Р. 1030.
5. Klivleyeva N.G., Lukmanova G.V., Glebova T.I., Shamenova M.G., Saktaganov N.T., Duysenova K.V. Molecular diagnostics and genetic characteristics of influenza A/H1N1 virus circulating in the territory of the West Kazakhstan in 2012-2014 // Journal of Clinical Virology. – Edinburg: 2015.- Р. 22.
6. Ишмухаметова Н.Г., Глебова Т.И., Кузнецова Т.В., Шаменова М.Г., Дуйсенова К.В. Циркуляция вирусов гриппа в Казахстане в эпидемические сезоны 2009 – 2013 гг. // Мат-лы науч.-практич. конференции «Профилактическая медицина: вчера, сегодня, завтра». – Омск: 2013. - С. 57-59.
7. Онищенко Г.Г., Ежова Е.Б., Лазикова Г.Ф. и др. Пандемия гриппа А/H1N1/09 в мире и Российской Федерации в 2009-2010 гг. и прогноз на 2010-2011 гг. // ЖМЭИ. – 2010. - № 6. – С. 12-17.
8. Иванова В.Т., Матюшина Р.О., Слепушкин А.Н. и др. Эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В в сезоне 2005-2006гг. в России // Вопр. вирусол. - 2008. - №4. - С.13-18.
9. Hoffmann E, Stech J, Guan Y et. al .Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. // Arch Virol. - 2001. - № 146 (12). - Р. 2275-89.
10. Reed L., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Amer. J. Hyg.- 1938.- Vol. 27.- P.493.
11. Douwdal W.A., Kendal A., Noble G.R. Influenza virus //Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection. – Washington: 1979. - P. 585-609.
12. Amino D. Method for the quantitative estimation of N-acetilneuraminic acid and their application to hidrolysates of sialomucoids // Biochtm. - 1961. - Vol. 81. - P. 384-392.