Разработка методики идентификации антибиотиков – производных фторхинолона в сточных водах для нужд экотоксикологического мониторинга

Определена чувствительность хроматографического определения антибиотиков фторхинолонового ряда в водных объектах методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Предложены высокочувствительные реактивы для детектирования зон адсорбции в тонких слоях сорбента и определена система растворителей, которая обеспечивает наилучшую хроматографическую подвижность исследуемых соединений.

Целью работы является разработка экспрессной методики идентификации в сточных и поверхностных водах загрязнителей класса антибиотиков фторхинолонового ряда методом ТСХ.

Результаты. Проведены экспериментальные исследования методом ТСХ русловий определения антибиотиков фторхинолонового ряда в водных объектах.

Выводы. Разработаны условия хроматографического определения антибиотиков фторхинолонового ряда для нужд экотоксикологического мониторинга сточных вод.

Введение. Антропогенное загрязнение окружающей среды вредными веществами входит в число глобальных проблем здравоохранения. В последнее время проблема поступления лекарственных средств в окружающую среду приобретает все большую обеспокоенность. Многими исследованиями доказано, что лекарственные средства попадают в окружающую среду через сточные воды в результате или неправильной утилизации, или неэффективной очистки. Антибиотики являются одними из новых загрязнителей, которые вызывают особое беспокойство.

Ряд исследований обнаружили, что даже водопроводная вода содержит следовые концентрации антибиотиков [1,. Значительное поступление в окружающую среду антибактериальных препаратов, их неконтролируемое использование и неправильная утилизация, приводят к формированию резистентности микроорганизмов к антибиотикам.Вследствие развития резистентности возникают инфекции, которые невозможно устранить с помощью антибактериальных средств, обычно используемых для лечения инфекционных заболеваний. В результате этого, под угрозой находится использования антибиотиков в качестве лекарств, спасающих жизни многих людей во всем мире [3]. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет устойчивость к антибиотикам, как одну из основных проблем современной медицины.На данный момент, устойчивость к антимикробным препаратам распространяется быстрее, чем когда-либо прежде, создавая угрозу для многих важнейших средств борьбы против инфекций [4].

Все это требует действий на разных уровнях общества, в том числе и проведения исследований и мониторинга наличия антибиотиков в сточных и поверхностных водах.

В предыдущих работах нами были рассчитаны прогнозируемые экологические концентрации (PEC) для наиболее популярных антибиотиков в Украине[4]. Среди приоритетных загрязнителей класса антибиотиков: пенициллины, фторхинолоны, макролиды.

В соответствии с источником[5, 6],наличие антибиотиков в неочищенных сточных водах колеблется от 3,9 нг/л до приблизительно 27 000 нг/л. В работах [7, 8]для идентификации антибиотиков используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс- детектированием (LC/MS). Этот метод является высокочувствительным, но его использование ограничено во многих лабораториях Украины из-за недостаточного обеспечения необходимым оборудованием.

Целью настоящей работы стала разработка экспрессной методики идентификации в сточных и поверхностных водах загрязнителей класса антибиотиков фторхинолонового ряда методом ТСХ после предварительного концентрирования.

Материалы и методы.В качестве объектов исследования использованы модельные растворы антибиотиков ципрофлоксацина, норфлоксацина и офлоксацина в концентрациях30 мкг/мл и модельные растворы антибиотиков в воде очищенной и воде водопроводной в концентрациях около 0,3 мкг/л.

Для приготовления модельных растворов использовали готовые лекарственные формы в форме растворов: капли глазные/ушные, содержащие: ципрофлоксацин («Ципофарм», ПАО «Фармак», Украина), норфлоксацин («Норфлоксацин», ООО «ГП «ГНЦЛС», Украина), офлоксацин («Унифлокс», ООО «Унимед фарма», Словатская Республика) Исследования проводили на пластинках Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ (сорбент – силикагель СТХ-1ВЕ, фракция – 8–12 мкм, толщина слоя сорбента – 100 мкм, тип подложки – ПЭТФ)и пластинках ВЭТСХ (сорбент – силикагель КСКГ, фракция – 5– 30 мкм, толщина слоя сорбента – 130±25 мкм)с

предварительной проверкой хроматографической разделительной способности для ТСХ-пластин со слоем силикагеля в соответствии с рекомендациями Государственной Фармакопеи Украины (ГФУ) [9].

Результаты и их обсуждение.Выбор оптимальных хромогенных реагентов для идентификации антибиотиков фторхинолонового ряда методом ТСХ.Идентификацию антибиотиков производных фторхинолонов проводили на пластинках Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ. Для выявления целевых веществ использовали хромогенные реагенты, образующие с производными фторхинолона окраску: реактив Либермана [10], реактив Марки [10], реактив Эрдмана [10],реактив Драгендорфав модификации по Мунье [10],реактив ФПН

1. ,раствор нингидрина Р1 [9],раствор бромтимолового синего Р1 [9],раствор калий йодплатината подкисленный
2. ,пары йодаа также облучение УФ-светом (длина волны – 254 нм). Реактивы готовили непосредственно перед использованием.

Модельные растворы: растворы ципрофлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина с концентрацией 30 мкг/мл.

Методика проведения исследования. На хроматографические пластинки микропипеткой наносили соответствующие растворы исследуемых антибиотиков (ципрофлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина) с концентрацией 30 мкг/мл в количестве от0.3 мкг до 0.9 мкг. Пластинку высушивали на воздухе и обрабатывали соответствующим проявителем. Проводили визуальную оценку характерного окрашивания. Полученные результаты приведены в таблице1.

Таблица 1 – Чувствительность обнаружения ципрофлоксацина, норфлоксацина и офлоксацина хромогенными реагентами на пластинках Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ

Таблица 2 - Результаты хроматографической подвижности ципрофлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина (Rf)

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют, что обеспечивает подвижность офлоксацина

В результате проведенного исследования установлено, что наиболее чувствительными хромогенными реагентами является реактив Драгендорфа в модификации по Мунье и раствор нингидрина, которые образовывали окраски с растворами фторхинолонов в концентрации 0.3 мкг в пробе. С растворами ципрофлоксацина и офлоксацина калий йодплатинат подкисленный образует окраски в концентрации 0.3 мкг, а с раствором норфлоксацина - 0.6 мкг. Менее чувствительными являются реакции с раствором бромтимолового синего, парами йода и облучение УФ- светом - предел обнаружения составил 0.6 мкг.Не чувствительными оказались следующие реактивы: реактив ФПН, реактив Либермана, реактив Марки, реактив Эрдмана. Исследование хроматографической подвижности производных фторхинолона в различных подвижных фазах.В качестве подвижной фазы предложены следующие системы растворителей:

1. Метанол - система ТАЕ;
2. Метанол - 25% аммиак (100: 1,5) - система ТА;
3. Метанол - н-бутанол (60:40) - система TAF;
4. Хлороформ - метанол (90:10) - система ТС;
5. Хлороформ - этанол (90:10) - система TAJ;
6. Хлороформ - циклогексан - кислота уксусная ледяная (40:20:20) - система ТАК;
7. Этилацетат - система TF;
8. Этилацетат - метанол - 25% аммиак (85:10:5) - системаTE;
9. Ацетонитрил - 25% аммиак - метанол - метиленхлорид (10:20:40:40);

хроматографирование в системе №9 наилучшую хроматографическую ципрофлоксацина, норфлоксацина и иполностью соответствует современным представлениям о приемлемом значении Rf, которое находится в пределах 0.2

8 [16]. При хроматографировании в системах № 1-8 исследуемые вещества остаются на старте. Хроматографирование в системах № 10-13 не является оптимальным, поскольку подвижность веществ в этих системах не достаточно высокая.

Разработка методики концентрирования пробы для потребностей экотоксикологического анализа. Важным этапом подготовки проб в экотоксикологическом анализе является их концентрирование. Для этого используют ряд методов: экстракция, соосаждение, дистилляционные методы и т.п.

В нашем исследовании мы использовали метод отгонки, который был испытан на модельном растворе фторхинолона.

Приготовление модельного раствора.В колбу емкостью 1 л вносили 1 мл соответствующего фторхинолона концентрацией 30 мкг/мл или их смеси соответствующей концентрации. Добавляли водопроводную воду до 1 л.

Методика концентрирования и определения фторхинолонов в модельном растворе.Модельный раствор ципрофлоксацина выпаривали под вакуумом при

1. Ацетонитрил - 25% аммиак - этанол - хлороформ (10:20:40:40);
2. Метанол - 25% аммиак - этилацетат - ацетонитрил (1:1:2:1);
3. Этанол - 25% аммиак - этилацетат - ацетонитрил (1:1:2:1);
4. Ацетонитрил - 25% аммиак - метанол - хлороформ (5:5:20:20).

Системы №1-8 - общие системы, которые рекомендованы Международной ассоциацией судебных токсикологов (TIAFT)[12, 13]для идентификации лекарственных соединений. Системы № 9-13 -специальные системы для определения производных фторхинолона[14, 15].

Модельные растворы: растворы ципрофлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина с концентрацией 30 мкг/мл.

Методика проведения исследования. Перед проведением исследования хроматографическую камеру насыщали парами соответствующего элюента в течение 30 мин. На линию старта хроматографической пластинки наносили по 10 мкл (0.3 мкг) ципрофлоксацина, норфлоксацина и офлоксацина. Пластинку помещали в хроматографическую камеру и элюировали в системах растворителей № 1-13. Длина пути пробега растворителей составляла 7.5 см. Пластинку извлекали и высушивали в потоке теплого воздуха. Для выявления зон адсорбции исследуемых веществ хроматографические пластинки просматривали в УФ-свете и обрабатывали реактивом Драгендорфа в модификации по Мунье.Результаты хроматографического исследования приведены в таблице 2. постоянной температуре 35-40°С до сухого остатка. Затем сухой остаток разбавляли 1 мл метанола, отфильтровывали через бумажный фильтр. Наносили 5 мкл полученного раствора на хроматографическую пластинку. Хроматографирование проводили в системе растворителейацетонитрил - 25% аммиак - метанол - метиленхлорид (10:20:40:40). После обработки хроматограммы раствором Драгендорфа в модификации по Мунье,наблюдали пятно кирпично-красного цвета (Rf = 58), что полностью соответствует исследованию хроматографической подвижности ципрофлоксацина. 

Выводы:

Исследованы условия идентификации антибактериальных средств - производных фторхинолона хромогенными реагентами при использовании метода ТСХ. Выявлено, что наиболее чувствительным для определения фторхинолонов является реактив Драгендорфа в модификации по Мунье.

Исследована хроматографическая подвижность ципрофлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина в различных подвижных системах. Определена система растворителей, которая обеспечивает наилучшую хроматографическую подвижность исследуемых соединений.

Разработана методика концентрирования пробы, содержащей производные фторхинолона, методом отгонки под вакуумом. Препаративность методики доказана методом ТСХ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ValcarcelY., AlonsoS.G., Rodriguez-Gil J.L. et al.Detection of Pharmaceutically Active Compounds in the Rivers and Tap Water of the Madrid Region (Spain) and Potential Ecotoxicological Risk// Chemosphere. – 2011. – Vol. 84. – P. 1336–1348.
2. YiruhanY., WangQ., Mo C.et al.Determination of Four Fluoroquinolone Antibiotics in Tap Water in Guangzhou and Macao// Environ. Pollut. – 2010. – Vol. 158. – 2350–2358.
3. Håstein, T. Disease problems, use of drugs, resistance problems and preventive measures in fish farming world-wide // Proceedings of the first International Symposium on Sustainable Fish Farming, Rotterdam, 1994. – Р. 183–194.
4. LaxminarayanR., DuseA., Wattal C. et al. Antibiotic resistance-the need for global solutions// Lancet Infect Dis. – 2013. – Vol. 13(12). – P.1057–1098.
5. ЕвсееваЛ.В., НетёсоваК.Ю., ГубинЮ.И. и др.Оценка фармацевтических загрязнителей поверхностных вод Украины // Управління, економіка та забезпечення якості в фармацiï. - 2016. - № 4 (48). - С. 4-10.
6. HuangC.H., RenewJ.E., SmebyK.L. et al.Assessment of potential antibiotic contaminants in water and preliminary occurrence analysis// Water Resou Update. - 2001. - Vol. 120. - P. 30-40.
7. 7.TrenholmR.A., VanderfordB.J., Holady J.C. et al.Broad Range Analysis of Endocrine Disruptors and Pharmaceuticals Using Gas Chromatography and Liquid Chromatography Tandem Mass Spectroscopy // Chemosphere. - 2007. - № 65. - P. 1990-1998.
8. Lopez de Alda M.J., Díaz-Cruz S., Petrovic M., Barceló D. Liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry of selected emerging pollutants (steroid sex hormones, drugs and alkylphenolic surfactants) in the aquatic environment // Journal of Chromatography A. - 2003. - Т. 1000, №. 1. - P. 503-526.
9. Державна Фармакопея Украïни: у 3 т. / Держ. служба Украïни з лiк. засобiв, Укр. наук. фармакоп. центр якостi лiк. засобiв. - 2-ге вид. - Харкiв: Укр. наук. фармакоп. центр якостi лiк. засобiв, 2014. - Т. 1. - С. 55-62.
10. Крамаренко, В. П. Токсикологiчна хiмiя. - Киïв: Вища шк., 1995. - 423 с.
11. MoffatA.C., OsseltonM.D., Widdop B. et al.Clarke's analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material: 4-th edition. - London, Chicago: Pharmaceutical Press, 2011. - 2736 p.
12. The International Association of Forensic Toxicologists. -тРежим доступа: http://www.tiaft.org/, свободный. - Загл.с экрана.
13. Clarke's Analytical Forensic Toxicology / Ed. by Sue Jickells, Adam Negrusz. - London : Pharmaceutical Press, 2008. - 648 p.
14. Державна Фармакопея Украïни / Державне пiдприeмство «Hауково-експертний фармакопейний центр». - 1-е вид. - Доповнення 2. - Харкiв: Державне пiдприeмство «Hауково-експертний фармакопейний центр», 2008. - 620 с.
15. ДорофеевВ.Л., КоноваловА.А., КочинВ.Ю., Арзамасцев А.П. Анализ лекарстенных средств группы фторхинолонов методом ТСХ // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - Т. 38, № 9. - С. 45-47.
16. Гейсс. Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография). -М.: 1999. - Т.1. - 149 с.