Структура хромосомной патологии у пациентов с бесплодием перед применением вспомогательных репродуктивных технологий

За период 2009–2015 гг. в генетической лаборатории Медицинского центра репродукции человека «ЭКОЛАЙФ» проведено цитогенетическое обследование 2976 пациентов в программах вспомогательных репродуктивных технологий, из них 1651 — женщина и 1325 — мужчин. Представленные результаты выявили значительный вклад (15,6 %) хромосомных аномалий при нарушениях репродуктивной функции, которые свидетельствуют об актуальности и целесообразности цитогенетического обследования супружеских пар в программе экстракорпорального оплодотворения.

В настоящее время бесплодие считается одной из важнейших социальных и медицинских проблем. Частота бесплодного брака составляет 10–20 % от общего числа супружеских пар (по данным ВОЗ за 2009 г.). В Республике Казахстан реальная статистика частоты бесплодного брака отсутствует. По различным данным, его частота колеблется от 12 до 15,5 % [1].

Использование экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) позволяет реализовать функцию деторождения при различных заболеваниях, которые ранее считались абсолютно бесперспективными в лечении, однако при этом возникает повышенный риск передачи генетических нарушений потомству, в первую очередь нарушений репродуктивной функции.

Генетические исследования последних лет свидетельствуют, что значительная часть нарушений репродукции обусловлена генетическими факторами и, в частности, хромосомными аномалиями [2–4]. Хромосомная патология в популяции составляет в среднем 1 %, а среди пациентов с нарушениями репродуктивной функции частота хромосомных аномалий, по данным разных исследователей, достигает 20 % [5–8]. В связи с этим большое значение имеет цитогенетическое обследование пациентов с заболеваниями связанными с бесплодием, привычным невынашиванием, наличием в анамнезе ребёнка или плода хромосомной патологии или множественных пороков развития, врождённой аплазией и гипоплазией внутренних половых органов, аменореей, задержкой полового развития, нарушениями сперматогенеза.

В Астане Медицинский центр репродукции человека «ЭКОЛАЙФ» оказывает весь спектр услуг по диагностике и лечению всех форм мужского и женского бесплодия современными методами вспомогательных репродуктивных технологий. Нами проведен анализ цитогенетических исследований за период 2009–2015 гг.

Цель исследования: изучение структуры хромосомной патологии у пациентов, обследованных перед проведением программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Материалы и методы исследования

Проведено цитогенетическое обследование 2976 пациентов в программах ВРТ, из них 1651 — женщина и 1325 — мужчин.

Исследование проводилось на препаратах, полученных путем культивирования лимфоцитов периферической крови в условиях in vitro. При культивировании использовалась стандартная методика с применением культуральной среды RPMI и эмбриональной телячьей сыворотки, в качестве стимулятора роста клеток добавлялся фитогемаглютинин. Культивированные клетки обрабатывали гипотоническим раствором (0,56 % КCl), а затем фиксировали в метанолуксусной смеси (3:1). Для дифференциального окрашивания хромосом использовалась методика GTG-banding с обработкой препаратов трипсином [9]. 

Анализ хромосом проводился на клетках в стадии метафазы, с помощью микроскопа Olympus BX61, оснащённого цифровой камерой и  программой  автоматического  кариотипирования Cytovision 3.9. При проведении кариотипирования руководствовались правилами, рекомендованными для цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы [10].

Результаты исследования и обсуждение

Цитогенетические находки составили 15,6 % (462 случая) от общего количества обследований (рис. 1), 12,3 % на хромосомный полиморфизм и 3,3 % на иные хромосомные аномалии, что согласуется с данными литературы [5–7].

Рисунок 1. Цитогенетические находки 2009–2015 гг. (n=2976) 

Общая структура выявленных хромосомных аномалий представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Структура хромосомных аномалий 

Распределение цитогенетических находок у мужчин и женщин представлено в таблице 1. 

Цитогенетические находки (n=462)

Т а б л и ц а  1

Структура хромосомных аномалий в наших исследованиях представлена в таблице 2. 

Структура хромосомных аномалий (n=462)

Т а б л и ц а  2

Согласно данным литературы, частота носителей сбалансированных структурных перестроек хромосом значительна и составляет в среднем 1:400–500 в популяции [4, 9, 11, 12].

В наших исследованиях сбалансированные структурные перестройки были выявлены у 68 пациентов и представлены реципрокными транслокациями (2,59 %), транслокациями между аутосомами и половыми хромосомами (0,64 %), робертсоновскими транслокациями (1,94 %), а также инверсиями хромосом 7, 9 и Y (1,08 %, 8,32 % и 0,4 % соответственно).

Наиболее часто (у 38 пациентов) встречалась перицентрическая инверсия 9-й хромосомы 46, ХХ/46, ХY, inv (9) (рис.2, табл.2). Данная аномалия, по нашим данным, составила 8,32 % и согласуется с данными других авторов [12, 13]. Эта распространенная структурная сбалансированная хромосомная аберрация считается парафизиологическим вариантом нормального кариотипа, который не приводит к каким-либо фенотипическим проявлениям. Однако существует много сообщений относительно носителей перицентрической инверсии 9-й хромосомы, у которых выявляются различные нарушения репродуктивной функции. К ним относят повторяющиеся выкидыши в анамнезе, замершие беременности, рождения детей с МВПР, бесплодие, многократные неудачные попытки ЭКО [12].

Сбалансированные хромосомные перестройки (транслокации и инверсии) среди мужчин и женщин встречались с примерно одинаковой частотой (2,2 % и 2,3 % соответственно). Однако робертсоновские транслокации у женщин выявлялись в 2 раза чаще, чем у мужчин. Во всех случаях робертсоновских транслокаций в образовании дериватов участвовала хромосома 14, что коррелирует с данными других исследователей [12].

Таким образом, сбалансированные структурные перестройки в наших исследованиях составили 2,25 %, что значительно превышает общепопуляционную частоту и согласуется с данными других исследователей [11,12].

Несбалансированные хромосомные аномалии в исследуемой группе (n =2976) представлены дупликациями 6 и 9 хромосом (17 случаев), делециями 15 и X-хромосом, фрагильной 12 и сверхчисленной маркерной хромосомами (по 1 случаю), а также в 5 случаях был выявлен добавочный генетический материал неизвестного происхождения на хромосомах 15, 21, 22. Несбалансированные хромосомные перестройки в данной выборке составили 0,7 %. По литературным данным, этот показатель колеблется от 0,8 до 1,2 % [3; 8].

Аномалии половых хромосом у женщин представлены мозаичными вариантами синдрома Шерешевского-Тернера (45, Х/46, ХХ) (4 случая) и структурной аномалией Х-хромосомы — 46, Х, del(Х) и составили 0,3 %.

Обычно хромосомный мозаицизм выявляется случайно, как цитогенетическая находка. Как правило, клиническая картина при мозаицизме выражена не так ярко, как у лиц с полной формой болезни. Степень клинического проявления зависит от количества и величины присутствующих клонов клеток. Чем меньше в организме аномальных клеток по отношению к нормальным, тем слабее проявления. Этим можно объяснить стертые формы данных заболеваний. Пациенты с мозаичным кариотипом фенотипически нормальны, аномалий полового развития нет, репродуктивная функция не нарушена, 1/3 из них имеют здоровых детей. Однако часто у пациентов с минимальным (скрытым) мозаицизмом диагностируется первичное бесплодие, невынашивание (часто с аномальным кариотипом у абортуса), неудачные попытки ЭКО. Эти данные согласуются с данными литературы [14–16].

У мужчин числовые аномалии половых хромосом представлены мозаичными и полными вариантами синдрома Клайнфельтера и дисомии Y-хромосомы (12 и 3 случая соответственно).

Синдром Клайнфельтера, встречаясь в мужской популяции с частотой 0,2 %, является наиболее частой формой  мужского  гипогонадизма,  обусловленного  нарушением  числа  половых  хромосом  [7]. В исследуемой группе синдром Клайнфельтера встречался почти в пять раз чаще, чем в общей популяции и составил 0,9 %.

Синдром дисомии Y-хромосомы в популяции встречается с частотой 1 случай на 1000 мужчин (0,1 %). Обычно мужчины с дисомией Y-хромосомы фертильны, но из-за присутствия дополнительной половой хромосомы повышается риск возникновения в сперматозоидах анеуплоидии по половым хромосомам [7, 17, 18]. Среди мужчин исследованной группы синдром дисомии Y-хромосомы составил 0,23 %.

Таким образом, частота числовых аномалий половых хромосом у мужчин составила 1,1 %, что не противоречит данным других исследователей [5, 6, 15, 19]. 

В 3 случаях у пациентов при мужском фенотипе имел место женский кариотип 46, ХХ, что составило 0,1 % и согласуется c литературными данными [17, 19, 20]. В общей популяции инверсия пола — синдром де ля Шапелля встречается с частотой 1 на 20000 мужчин и характеризуется нарушением развития половых органов и отсутствием сперматогенеза.

Хромосомный полиморфизм характеризуется увеличением гетерохроматиновых районов 1, 9, 16  и Y-хромосом, а также спутников и спутничных нитей акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21 и 22.

Считается [13, 21, 22], что увеличенные гетерохроматические участки, являясь более тяжелыми, нарушают процесс расхождения хромосом во время деления клетки, что приводит к образованию несбалансированных гамет. Также установлено [23, 24], что особенности строения гетерохроматина могут оказывать существенное влияние на функционирование генов, расположенных рядом. Клинически это может проявляться хромосомными болезнями у потомства, бесплодием, привычным невынашиванием, замершими беременностями, многократными неудачными попытками ЭКО.

Хромосомный полиморфизм явился наиболее частой (364 случая) цитогенетической находкой в наших исследованиях и в структуре цитогенетических находок составил 78,8 %. Следует отметить, что в исследуемой группе хромосомный полиморфизм встречался чаще у мужчин, чем у женщин (14,1 % и 10 % соответственно) и составил 12,2 %, что не противоречит международным данным [13, 25].

Так, увеличение гетерохроматиновых участков аутосом 1, 9 и 16, спутников и спутничных нитей акроцентрических хромосом встречалось в 10,1 %.

У 40 мужчин отмечено значительное увеличение длинного плеча Y-хромосомы (46, Х, Yqh+) и в 23 случаях уменьшение длинного плеча Y-хромосомы (46, Х, Yqh-). Таким образом, у 4,7 % обследованных мужчин обнаружено изменение гетерохроматиновых районов Y-хромосомы, эти данные перекликаются с данными литературы [19, 24].

Представленные результаты наглядно показывают значительный вклад (15,6 %) хромосомных аномалий (у мужчин 18,5 %, у женщин 13 %) при нарушениях репродуктивной функции.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об актуальности и целесообразности цитогенетического обследования супружеских пар в программе ЭКО. Установление генетических причин патологических состояний значительно меняет тактику ведения и принципы терапии таких пациентов, создаёт условия повышения эффективности лечения бесплодия методами ВРТ. 

Список литературы

1. Локшин В.Н., Джусубалиева Т.М. Бесплодие и вспомогательные репродуктивные технологии — Алматы, —С. 275.
2. Черных В.Б., Курило Л.Ф., Адамян Л.В. Актуальность медико-генетического обследования и консультирования в репродуктивной медицине // Проблемы репродукции. — 2008. — Спец. вып. — С. 25,26.
3. Ворсанова С.Г., Берешева Л.З., Казанцева Л.З., Демидова И.А., Шаронин В.О., Соловьев И.В., Юров Ю.Б. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных аномалий у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции // Проблемы репродукции. — 1998. — № 4. — С. 41–46.
4. Stern , Pertile M., Norris H., Hale L., Baker H.W.G. Chromosome translocations I couples with in-vitro fertilization implantation failure // Hum. Repr. — 1999. — Vol. 14. — No. 8. — Р. 2097–2101.
5. Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Гришина Е.М. Структура наследственных нарушений репродуктивной системы // Вестн. РАМН. — 2000. — № 5. — С. 32–36.
6. Курило Л.Ф. Частота и структура хромосомных аберраций у пациентов с репродуктивной недостаточностью // Мед. генетика. — 2007. — Т. 6. — № 10. — С. 41–44.
7. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. Хромосомные синдромы и аномалии. Классификация и номенклатура. —Ростов н/Д.: Изд-во Ростов. гос. мед. ун-та, 1999. — С. 107–112.
8. Тавокина Л.В. Молекулярно-цитогенетическая диагностика в лечении пациентов с нарушением репродукции // Медицинские аспекты здоровья женщин. — 2007. — № 3. — Вып. 6. — С. 20–25.
9. Кузнецова Т.В., Логинова Ю.А., Чиряева О.Г. и др. Цитогенетические методы // Медицинские лабораторные технологии. — Т.2. / Под ред. А.И.Карпищенко. — М., 1999. — С. 550–578.
10. Назаренко С.А. Тест-система внешнего контроля качества цитогенетических исследований в учреждениях медикогенетической службы / Назаренко С.А., Васильева Е.О. — Томск: Печатная мануфактура,
11. Политко А.Д., Лазюк Г.И. Цитогенетические особенности носителей сбалансированных конституциональных перестроек хромосом // Здравоохранение. — 1998. — № 1. — С. 16–18.
12. Тавокина Л.В., Баронова Е.В., Сопко Н.И. Наиболее часто встречающиеся хромосомные аномалии в кариотипах пациентов с репродуктивными нарушениями // Клиника «Исида», Киев // Цитология и генетика. — 2007. — №
13. Цветкова Т.Г. Полиморфизм хромосом в контингенте супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 
14. Беспалова Н.О. Генетика невынашивания беременности // Журн. акуш. жен. болезн. — 2007. — Т. LVI. — Вып. — С. 81–95.
15. Ворсанова С.Г., Шаронин В.О., Курило Л.Ф. Аномалии половых хромосом при нарушениях репродуктивной функции у мужчин // Проблемы репродукции / Под ред. С.Г.Ворсановой.— 1998. — Т.4. — № 2. — С. 12–21.
16. Курило Л.Ф. Хромосомные заболевания органов половой системы // Клин. и эксперим. морфология. — 2015. — № 1. —С. 48–59.
17. Черных В.Б. Генетические факторы мужского бесплодия // Мед. генетика. — 2006. — С. 8–14.
18. Гоголевская И.К., Гоголевский П.А. Y-хромосома и мужское бесплодие // Проблемы репродукции / Под ред. И.К.Гоголевской. — 1999. — № 5. — С. 15–20.
19. Чистяков В. В., Ладыгина В. В., Безруков Р. В. Цитогенетическое исследование вариабельности гетерохроматиновых районов хромосом у пациентов с проблемами репродукции // Репродуктивная медицина.— — № 3, 4. — С. 8, 9.
20. Фёдорова И.Д., Кузнецова Т.В. Генетические факторы мужского бесплодия // Журн. акуш. жен. болезн. — 2007.— Т. LVI. — Вып. 1. — С. 64–72.
21. Бочков Н.П. Клиническая генетика: учебник. — 3-е изд. — М.: ГЭОТАР-Медиа,
22. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. — М.: Наука, 1986. — 430 с.
23. Жимулёв И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. — Новосибирск: Наука, 1993. — С. 1–490.
24. Подугольникова О.А и соавт. Гетерохроматические районы хромосом 1, 9, 16 и Y у человека и фенотип // Генетика. — 1984. — Т. 20. — № 3. — С. 496–500.
25. Барцева О.Б., Пулина Г.А. и др. Цитогенетическое обследование супружеских пар в программе ЭКО // Проблемы репродукции. — 1998. — № 4. — С. 37