Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Получение компонентов нутталийного диагностикума

Разработана технология получения нутталийного гамма-глобулина как одного из компонентов диагностикума для постановки серологических реакций на нутталиоз лошадей. Отработаны оптимальные условия иммунизации лабораторных животных нутталийным антигеном, очистки и концентрации нутталийного гамма-глобулина.

Введение

Нутталиоз лошадей – трансмиссивное сертифицируемое при ввозе и вывозе лошадей остро, подостро, реже хронически протекающее заболевание, характеризующееся явлениями перемежающейся лихорадки, угнетением, анемией,  желтушностью (лимонного, шафранного цвета), истощением, нарушением сердечно-сосудистой, дыхательной и пищеварительной систем, вызываемое специфическими облигатными внутри эритроцитарными простейшими паразитами отряда Piroplasmida (), семейства Theileriidae (Du Toit, 1918), рода Nuttallia (Franca, 1909) [1].

Впервые  наблюдали  паразитов  в  крови  лошади  Guglielmi  в  1899  г.  в  Италии  и Rickmann  в  1900  г.  в  Юго-Западной  Африке.  Нутталиоз  лошадей  и  его    возбудителя подробно описали в 1901 г. L.Laveran и A.Theiler. Название паразиту - Nuttallia equi присвоили лишь в 1910 г. ученые Nuttall и Strickland, подтвердив название, данное паразиту ученым Franca в 1909 г. В России нутталиоз впервые описал Н.А.Михин в 1908 г., а затем он же и В.Л.Якимов в 1909 г., но они считали эту болезнь пироплазмозом [2].

Заболевание лошадей нутталиозом зарегистрировано во многих странах Африки, Европы, Азии, Центральной и Южной Америки. В 1976 г. нутталиоз впервые установлен в Австралии. На территории Союза нутталиоз имел широкое распространение в южных и восточных зонах страны и ряде регионов РСФСР [2].

Нутталиоз лошадей наносит значительный экономический ущерб в виде снижения массы тела, уменьшения приплода и его слабой жизнеспособности, ослабления половой активности и снижения качества спермы, сдерживания продуктивности, препятствии в улучшении породных качеств животных, смертности.

Диагностика нутталиоза проводится на основании учета эпизоотологического состояния местности, наличия специфических биологических переносчиков – иксодовых клещей рода Dermacentor, сезона года, клинических признаков и результатов микроскопического и серологического исследования. Решающим моментом в постановке положительного диагноза являются результаты исследования мазков крови. Нутталии выделяются при окрашивании мазков периферической крови краской Гимза по Романовскому в виде так называемого «мальтийского креста» или в виде четырех точек, в основном, по периферии эритроцита [1,2]. Однако, своеобразная, малая форма возбудителя в виде нескольких точек при нутталионосительстве, наличие в крови здоровых животных некоторых включений (тельца Жолли и др.), трудно отличимых от нутталий, зачастую затрудняют диагностику нутталиоза и, особенно, нутталионо- сительства, которое длится после клинического выздоровления до 15-18 лет и которое служит постоянным источником для заражения кровососущих клещей и распространения заболевания среди здоровых, особенно племенных лошадей. Методы биопробы и спленэктомии подозреваемых в нутталионосительстве животных, как это рекомендовано для жвачных животных, в данном случае не всегда осуществимы из-за громоздкости и дороговизны.

Все перечисленные трудности обнаружения нутталий и их дифференциации от пироплазм, артефактов, различных включений крови, особенно, в начале болезни и при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать и совершенствовать специфические и более эффективные средства диагностики.

Вопрос применения серологических диагностических тестов при  кровепаразитозах, в том числе при нутталиозе издавна интересовал исследователей, так как этим методом помимо клинически выраженной болезни можно безошибочно выявить скрытое паразитоносительство. Кроме диагностической значимости иммунологические реакции необходимы для изучения и расшифровки сущности иммунных процессов в организме больных и переболевших животных, раскрытие которых ускорит решение проблемы специфической профилактики.

Серологические методы диагностики при кровепаразитозах (анаплазмозе) впервые применили Сплиттер с сотр. [3]. В СНГ работы по внедрению серологической диагностики при различных кровепаразитозах, по отработке методики приготовления антигена из паразитов проводили Н.И.Степанова, Х.Георгиу, Т.Т.Сулейменов, Г.С.Шабдарбаева [4, 5, 6, 7, 8].

В Казахстане для серологической диагностики нутталиоза лошадей антиген из инвазированной паразитами крови был разработан и апробирован К.Т.Раисовой [9].

Анализ литературных данных показывает, что в настоящее время иммунологические исследования   при   инвазионных   заболеваниях   животных,   в   т.ч.   при       нутталиозе, направлены на обнаружение циркулирующих антител в сыворотке крови [10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17].

Однако, по мнению ряда авторов [10,14] анализы этого типа недостаточно объективны и, более того, сам принцип обнаружения  антител характеризуется невысокими предсказательными возможностями, т.к. в начальной стадии инвазии или при ее протекании в легкой форме уровень антител может быть ниже предела чувствительности обнаружения, что порождает ложноотрицательные ответы. И, наоборот, в некоторых случаях специфические антитела могут сохраняться в кровотоке на заметном уровне даже спустя длительное время после выздоровления, из-за чего при проведении иммуноанализа могут быть получены ложноположительные ответы. Кроме  того, в отличие от методов обнаружения антигенов количественное определение антител невозможно, поскольку на результаты иммуноанализа могут влиять и афинность антител [12, 17].

Многие иммунологические тесты в качестве необходимого компонента требуют использования антисывороток к паразитарным антигенам, либо выделенных из них гамма- глобулиновых фракций. Однако, у естественно инвазированных животных титр антител, как правило, невысок и они малопригодны в качестве стандартных реагентов.

С учетом вышеизложенного, нами была разработана технология получения нутталийной сыворотки и нутталийного гамма-глобулина, который был выделен из гипериммунных сывороток крови кроликов к нативному нутталийному антигену и использован при постановке иммуноферментного анализа в качестве стандартного реагента для прижизненной диагностики нутталиоза лошадей.

Материалы и методы

На первом этапе исследований подбирали с учетом реактивности  организма опытных животных – лошадей двухлеток и ослов. Заражали их кровью, содержащей нутталии от опытных животных-доноров с трилоном-Б. Регулярными микроскопическими исследованиями периферической крови зараженных животных следили за нарастанием паразитемии. Для усиления паразитемии у некоторых животных использовали спленэктомию, т.е оперативное удаление селезенки – иммунокомпетентного органа. На высоте паразитемии, равной примерно 60–80 % из крови экспериментально зараженных нутталиозом ослов готовили корпускулярные нутталийные антигены по методу Н.И.Степановой (1970) в модификации К.Т.Раисовой. Корпускулярные антигены переводили в растворимое состояние путем дезинтеграции на аппарате УЗДН-3 (экспозиция – 10 мин.) и далее использовали для иммунизации кроликов с целью наработки паразитспецифичных антисывороток. Нами вначале были испытаны три метода иммунизации лабораторных животных корпускулярным нутталийным антигеном, предложенных H.Fey et all.(1976), А.М.Сафроновым (1976) и Г.Фримелем (1987). Далее в процессе работы для получения более высоких титров антител на модели нутталиоза, а также на других паразитологических моделях нами была применена модифицикация метода иммунизации, сущность которой заключалась в комбинированном использовании методов H.Fey et all. (1976) и Г.Фримеля (1987), на что получены охранные документы РК за №№14076; 17196; 17203; 17204; 17722; 22021; 22022; 22023; 22154.

Результаты исследований

Разработанная нами схема технологического процесса получения сухой гамма- глобулиновой фракции к нутталийному антигену выглядит следующим образом:

Первая стадия. Получение корпускулярного нутталийного антигена из крови лошадей и ослов, экспериментальным путем зараженных нутталиями и спленэктомированных с целью усиления паразитемии.

Вторая стадия. Получение гипериммунных сывороток крови к нутталийному антигену путем иммунизации лабораторных животных нутталийным антигеном. 

Третья стадия. Выделение гамма-глобулиновой фракции из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания, ее концентрация.

Четвертая стадия. Составление серии нутталийного гамма-глобулина, расфасовка и этикетирование ампул.

Пятая стадия. Упаковка, маркировка и хранение гамма-глобулина.

Гипериммунные сыворотки крови получали иммунизацией кроликов (массой не менее 2,5кг) нутталийным антигеном по модифицированной нами методике. Иммунизацию кроликов проводили антигеном в дозе 1,5 мг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1 в подушечки четырех лапок по 0,25 см3 в каждую. Через 21 день кроликов реиммунизировали той же дозой антигена с ПАФ в бедренные мышцы обеих лапок по 0,5 см3 смеси в каждую.

Начиная с 7-го дня после второй иммунизации вели ежедневный контроль за титром преципитирующих антител реакцией количественной преципитации (РКП) или иммуноферментным анализом (ИФА). При достижении титра преципитирующих антител не ниже 1 мг/мл в РКП или 1:25000 в ИФА от кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 мл трехкратно, с интервалом в 72 ч.

При низких титрах антител (менее 1 мг/мл в РКП и ниже 1:25000 в ИФА) проводили дополнительную иммунизацию. Через 15 дней после реиммунизации проводили цикл внутривенных инъекций. Антиген в дозе 1,5 мг на кролика вводили двукратно с интервалом в 24 ч в центральную ушную вену. Во избежании аллергической реакции за 2 ч. до внутривенного введения кроликов сенсибилизировали малыми дозами антигена (25 мкг). Контроль за титром антител осуществляли в РКП или в ИФА. Собирали сыворотки отдельно от каждого иммунизированного кролика.

Затем из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания сульфатом аммония (50 %) выделяли гамма-глобулиновую фракцию по общепринятой методике. Выделенный гамма-глобулин растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и обессоливали на колонке с сефадексом G-50 или диализом против проточной воды (12 ч.), дистиллированной воды (24 ч) и физиологического раствора (24 ч).

После обессоливания гамма-глобулин концентрировали в диализных трубках на полиэтиленгликоле (ПЭГ) –600 до содержания белка 10 мг/мл.

Каждую серию гамма-глобулина одновременно расфасовывали в ампулы по 2 см3 с содержанием белка 10 мг/ см3. Подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. Ампулы этикетировали с указанием: наименования препарата, количества доз, даты изготовления, срока годности, номера серии.

Нутталийный гамма-глобулин представляет собой лиофилизированную гамма- глобулиновую фракцию, выделенную из гипериммунной сыворотки крови кроликов к нутталийному антигену и предназначен для использования при постановке иммуноферментного анализа для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных. Хранится в темном сухом помещении при температуре 2-10 С до 18 месяцев.

Полученный нутталийный гамма-глобулин испытывали в антиген выявляющем варианте ИФА с сыворотками крови спонтанно и экспериментально зараженных нутталиозом животных по методу A.Voller (1976), коньюгацию кроличьего JgG с пероксидазой и хрена Олайнского производства с показателем чистоты 2,7-3,2 производили по методу P.K.Nagane et all (1974).

Готовили карбонатно-солевой буферный раствор (рН 9,6) (КСБ) следующим образом: 0,1 М растворы натрия углекислого и натрия двууглекислого  на физиологическом растворе, затем к натрию углекислому приливали  натрий двууглекислый до рН 9,6.

Приготовление  фосфатно-солевого  буферного  раствора  (рН  7,2-7,4)  содержащего 0,05  %  твин  –80  (ФСБ-Т)  проводили  следующим  образом:  0,01  М  раствора     натрия фосфорнокислого однозамещенного приливали к двузамещенному натрию фосфорнокислому до рН 7,2-7,4. К фосфатно-солевому буферному раствору добавляли твин –80 из расчета 0,5 см3 на 1000 см3 буфера (0,05 %).

Субстратно-индикаторную смесь готовили следующим образом: 70 мг 5- аминосалициловой кислоты растворяли в 100 см3 дистиллированной воды при 70 оС, доводили рН до 6,0 0,1 М КОН и добавляли 0,16 см3 3%-ного раствора перекиси водорода.

Исследуемые сыворотки крови разводили КСБ 1:25.

Содержимое ампул с нутталийным гамма-глобулином растворяли 1:5000 в ФСБ-Т.

Разведение антител диагностических против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой (конъюгат) готовили согласно наставления по применению.

В лунки полистироловых иммунологических планшет вносили по 0,2 см3 раствора исследуемых сывороток крови, закрывали крышкой и инкубировали 18 ч при 4 0С или 3 ч при 37 0С. Затем планшеты промывали ФСБ-Т трижды и в лунки вносили раствор гамма- глобулина до 0,2 см3. Инкубировали 1 ч при 37 0С и промывали ФСБ-Т трижды, после чего в лунки вносили раствор антивидового кроличьего конъюгата по 0,2 см3. Инкубировали 1 ч при 37 0С и четыре-пять раз отмывали ФСБ-Т. Затем в лунки планшет вносили по 0,2 см3 субстратно-индикаторной смеси.

Останавливали реакцию через 20-40 мин добавлением в каждую лунку 0,05 см3 серной кислоты, приготовленной путем растворения 2 см3 концентрированной серной кислоты в 10 см3 дистиллированной воды.

Учет результатов реакции проводили визуально.

При наличии специфических нутталийных антигенов субстрат окрашивается в темно-коричневой дает. Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраски или имеющие слабое пожелтение.

Приготовленный нами гамма-глобулин к нутталийному антигену испытывался на чувствительность с заведомо позитивными нутталийными и заведомо отрицательными сыворотками в антигенвыявляющем варианте ИФА.

Результаты изучения чувствительности антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе лошадей, где в качестве стандартного реагента использован приготовленный нами нутталийный гамма-глобулин приведены в таблице 1. 

Таблица-1. Чувствительность антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе с применением нутталийного гамма-глобулина.

 Чувствительность антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе с применением нутталийного гамма-глобулина.

Из таблицы 1 видно, что наивысший титр регистрировался при разведениях позитивной сыворотки в соотношении 1:640. Реакция была положительной в случае исследования позитивных нутталийных сывороток и отрицательной при исследовании негативной сыворотки здоровых животных, что показывает на объективность теста и возможности использования нутталийного гамма-глобулина в ИФА для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных.

Обсуждение результатов

Таким образом, в результате проведенных исследований приготовлены вначале нутталийная   сыворотка,   затем   нутталийный   гамма-глобулин,   пригодный   в качестве стандартного реагента при постановке серологических реакций (ИФА) для прижизненной диагностики нутталиоза и для использования в качестве идиотипа при наработке антиидиотипических антител.

Противопоказаний к применению нутталийного гамма-глобулина не выявлено.

Выводы При конструировании диагностикума для серологической диагностики нутталиоза важным компонентом является гамма-глобулин, выделенный из гипериммунных сывороток, полученных в результате иммунизации лабораторных животных нативным нутталийным антигеном.

 

 Литература

  1. Крылов М.В.    Пироплазмиды    (фауна,    систематика,    эволюция)//Л.,    «Наука»,Ленинградское отделение, 1981. С. 61; 109-110.
  2. Петровский В.В., Абрамов И.В. Нутталиоз лошадей//В кн. Протозойные болезни сельскохозяйственных животных. Под редакцией Н.И.Степановой. -М., «Колос», С.73-79.
  3. Splitter E.J., Twiehus M.J., Castro E.R. Anaplasmosis in sheep in the United states (Manhatten Kansas), // J. Am. Vet. Med. Ass. – 1955. – Vol. 127. - № –P. 244-245.
  4. Степанова Н.И. Иммунитет и серологическая диагностика анаплазмозов и тейлериозов рогатого скота: Автореф. дисс. докт. вет. наук. - М., 1971.49 с.
  5. Георгиу Х.      Экспериментальный         анаплазмоз      овец      (симптомокомплекс, иммунологические реакции): Автореф. дисс. канд. вет. наук. – М., 1980. 25 с.
  6. Георгиу Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталиоза лошадей: Автореферат дисс. докт. биол. наук. - М., 1997. 50 с.
  7. Сулейменов Т.Т. Некоторые иммунобиологическое особенности A. ovis и совершенствование серодиагностики анаплазмоза. Дисс. канд. биол. наук. – Алма- Ата, 1986. 130 с.
  8. Шабдарбаева Г.С. Гемопаразитоценоз овец и иммунобиологические свойства антиидиотипических антител и диагностикумов при спонтанном и экспериментальном анаплазмозе овец. Дисс.канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1990. 139 с.
  9. Раисова К.Т. Нутталиоз лошадей (эпизоотология, диагностика): Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Алма-Ата, 1989. 20 с.
  10. Gingrich R.E. Aguired resisteance to Hypoderma lineatum. Comparative immunorestonse of resistent suspeptible cattle // Vet. Parasitol. -1982. -9-3-4. –P. 233-242.
  11. Carlier , Wery M. Methodes actualles de diagnosti immunologugue en parasitologie // Ann. Biol. Clin. – 1983. – 41. -6. – p. 435-444.
  12. Butler J.E., Feidbush T.L., Me Givern P.L., Stewardw. The enzimelinred immunosorbent assay (ELISA): a measure of antibody concentrion of affinity. // – 1978. - № 15. – р. 131-135.
  13. Carlier Y., Yang J., Bout., Capron A. The use of excretory-secretory antigen for of ELISA specific serodiagnos of visceral larva migrans // Biomedicine. – 1982. – 36.- p. 39-40.
  14. Noguera –Oueoros A. Lutsche C., Capron M., Dessaint I.P., Capron A. Delection and quantification of circulationg antigen in antibody // Clin. And Exp. Immunol. -1986/65. -№ 2. –Р. 223-231.
  15. Маканова А.Г. Биологические особенности личинок родов Gastrophilus, Rhinoestrus и иммунодиагностика ларвальных энтомозов лошадей.: Автореф. дисс. канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1989. 21 с.
  16. Аязбаев Д.М. Иммунологические аспекты паразитохозяинных отношений при эстрозе овец и меры борьбы.: Дисс.канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1990. 118 с.
  17. Алпаев Н.С. Иммунологические особенности личинок верблюжьего овода и паразитохозяинные отношения при цефалопинозе.: Дисс. канд. биол. наук. -Алма- Ата, 1992. 111 с. 

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.