Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Применение полимеразной цепной реакции в медицине

В статье приведены данные о возможностях применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в медицине. Описаны принцип и преимущества ПЦР как метода диагностики по сравнению с другими методами (ИФА, бакпосев). Определено, что ПЦР применяют в медицине для диагностики инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний, а также в персонализированной медицине. В статье рассмотрены возможности применения метода ПЦР для диагностики некоторых бактериальных и вирусных инфекций, передающихся половым путем, гепатитов, а также некоторых наследственных и онкологических заболеваний. Отмечено, что в персонализированной медицине ПЦР применяют для определения индивидуальных различии пациентов в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. 

Полимеразная цепная реакция, известная более как ПЦР, не сходит со страниц научных жур­налов с тех пор, как была открыта Кэри Б.Мюллисом в 1983 г., за что он и был удостоен Нобелевской премии в 1993 г. [1]. Часто ПЦР описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. «Иглой» является крошечный фрагмент генетиче­ского материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естест­венное свойство ДНК — репликацию (размножение), делает его копии.

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) — способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участкам НК-мишени. Прай-мер — самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким об­разом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонук-леотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофиль­ных бактерий Termus aquaticus). Указанную выше реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при ох­лаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых нуклеиновых кислот.

Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении следующих реакций:

  • Денатурация. Первый этап ПЦР состоит в тепловой денатурации образца ДНК выдерживани­ем его при температуре 95 °С в течение 1 мин. Помимо ДНК, в реакционной смеси содержатся в из­бытке 2 праймера, термостабильная ДНК-полимеразаTaq и 4 дезоксирибонуклеотида.
  • Ренатурация. Температуру смеси медленно понижают до 55 °С, при этом праймеры спарива­ются с комплементарными последовательностями ДНК.
  • Синтез. Температуру повышают до 75 °С величины, оптимальной для ДНК-полимеразыTaq. Начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3'-гидроксильной группой праймера [2].

Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате — термо-циклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии иден­тифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз, в соответствии с заданной програм­мой термоциклера. В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означа­ет, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что по­зволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии. Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксировано искусствен­но синтезированным праймером. 

Преимущества метода ПЦР

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностиче­скую чувствительность (рис.). Аналитическая чувствительность применительно к ПЦР представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов — г/э) ДНК или РНК в одном мил­лилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство ком­мерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК, если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-системы для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца.

Относительный предел измерения (аналитическая чувствительность) прямых методов диагностики

Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболевани­ем, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценива­ется в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригод­ность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем — диагностическая чувствитель­ность метода не должна быть ниже 95-98 %.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности — «специфичность» определяет­ся процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100 %.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосхо­дят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР стано­вится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких не­дель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые» или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60 %, ИФА — 50-70 %, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) — 55-75 %, культуральное исследование — 60­80 %, а ПЦР — от 90 до 100 %.

Как видно, ПЦР по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» по­лучения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить преимущества ПЦР перед други­ми методами клинической лабораторной диагностики.

  1. Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.
  2. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалисти­ка, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологи­ческих объектов.
  3. Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.
  4. Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количе­ственной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительно­сти коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в ис­следуемом образце.
  5. Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и авто­матизация метода позволяют получить результаты исследования врачом и пациентом в день проведе­ния анализа.
  6. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики. ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания, например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболе­вания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологи­ческих остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.
  7. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.
  8. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или ано­мальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.
  9. Возможность экспертизы. Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.
  10. Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР, так как ма­териал дезинфицируется лизисом и высокой температурой.

Несмотря на указанные выше достоинства, метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

Применение ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний

В настоящее время наиболее быстро развиваются следующие основные направления генодиаг­ностики:

  • диагностика инфекционных заболеваний;
  • диагностика онкологических заболеваний;
  • диагностика генетических заболеваний.

Метод ПЦР решает три главные последовательные задачи:

  • позволяет определять наличие или отсутствие патогена (или аномального гена);
  • в значительной мере отвечает на вопрос «лечить или не лечить?»;
  • позволяет оценить качество терапии путем контроля наличия или отсутствия возбудителя или аномального гена.

За последнее десятилетие методы амплификации нуклеиновых кислот уверенно вошли в лабора­торную практику диагностики урогенитальных инфекций [3-6]. Высокая чувствительность и специ­фичность ПЦР, ставшей для ряда инфекций «золотым стандартом», проверены временем и тщательно апробированы клинически. Необычайная чувствительность метода позволяет специалистам гаранти­рованно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетиче­ской информации. Аналитическая чувствительность АмплиСенс ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий — воспроизводимое выявление 100 микроорганизмов в исследуемой биологиче­ской пробе (1000 микроорганизмов в 1 мл). Специфичность ПЦР при использовании технологии Ам-плиСенс даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100 % [7].

Наиболее эффективно и обоснованно использование метода в урогинекологической практике — для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфек­ции, ВПЧ — вируса папилломы человека; в пульмонологии — для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии — для выявления гелико-бактериоза; в клинике инфекционных заболеваний — в качестве экспресс-метода диагностики саль-монеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии — для выявления цитомегалови-русной инфекции, онковирусов. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению рас­пространения инфекции [8].

Наиболее частой причиной воспалительных заболеваний урогенитального тракта являются хла-мидий и микоплазмы. Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis вызывают более половины всех негонококковых урогенитальных заболеваний, передающихся половым путем [9]. Клинические варианты хламидиоза и микоплазмозов разнообразны, чаще всего проявля­ются в виде подострого и вялотекущего уретрита, нередко осложненного простатитом, везикулитом, эпидидимитом у мужчин и эндоцервицитом, вагинитом, аднекситом и бартолинитом — у жен­щин [10]. По данным специалистов ВОЗ, ежегодно у около 50 млн. человек впервые диагностируется генитальный хламидиоз. Экологической нишей хламидийной инфекции является цилиндрический эпителий шейки матки, уретра и прямая кишка. Полагают, что около 10 % всех женщин и мужчин инфицированы Ch. trachomatis. При этом у пациентов хламидиоз протекает бессимптомно. Вместе с тем хламидии могут вызывать тяжелые заболевания, характеризующиеся как хронические воспале­ния малого таза, приводящие к бесплодию (женскому и мужскому) и другим последствиям. Для ди­агностики хламидиозной инфекции используют прямые (культуральные и молекулярно-генетические) и косвенные (определение специфических антител) методы диагностики. Наиболее доступным и эффективным является метод ПЦР.

В последнее время для диагностики заболеваний урогенитального тракта применяется метод ПЦР, позволяющий определять в биологическом материале ДНК Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis [11, 12]. Он зарекомендовал себя как метод, который может быть использован в практическом здравоохранении [13].

Так, С.В.Скворцовым (и др.) были изучены возможности ПЦР по выявлению хламидий и мико-плазм при урогенитальной патологии и определению чувствительности ПЦР и РИФ (реакции иму-нофлюоресценции) в диагностике хламидиоза. В таблице 1 приведены результаты обследования больных с негонококковыми воспалительными заболеваниями мочеполовых органов и их половых партнеров.

У мужчин Ch. trachomatis обнаружен в 24,2 % случаев, U. urealyticum — в 21,2 % и M. hominis — в 14,1 %; у женщин — соответственно в 23,3, 36,7 и 20 %. В Карагандинской области с помощью ме­тода ПЦР Ch. trachomatis обнаружен в 9,52 % случаях, U. urealyticum — в 57,89 %, M. hominis — в 27,47 % [14].

Используя ПЦР, удалось установить этиологию заболевания более чем в 60 % случаев. У жен­щин выявлялись чаще, чем у мужчин. Обращает на себя внимание большой процент носительства Ch. trachomatis у контактных лиц, что дает основание для обязательного обследования половых парт­неров. Также были выявлены смешанные инфекции. У женщин смешанные инфекции встречались в 2,5 раза чаще, чем у мужчин.

Диагностика хламидийной, уреаплазменной и микоплазменной инфекций у лиц с заболеваниями урогенитального тракта, %

При параллельном обследовании 86 больных на Ch. trachomatis методами ПЦР и РИФ установ­лено, что ПЦР оказалась более чувствительной: Ch. trachomatis обнаружена у 28 (32,6 %) больных, а с помощью РИФ — у 25 (29,1 %). Результаты исследований свидетельствуют о широких возможно­стях метода ПЦР для объективного комплексного исследования на хламидиоз и микоплазмозы боль­ных с негонококковыми воспалительными заболеваниями мочеполовых органов, высокой эффектив­ности и перспективности его применения в клинической практике [15].

Кроме того, в результате исследований, проведенных В.И.Киселевым (и др.), было установлено, что метод ПЦР может применяться в качестве критерия излеченности при хламидийной инфекции наряду с методом культуры клеток, который должен применяться в качестве подтверждающего теста при положительных результатах ДНК-диагностики [16].

Вирусные гепатиты (ВГ)

Современная таксономия вирусов гепатита человека представлена семью типами возбудителей: А, В, С, D, Е, G и TTV. Для каждого вида возбудителя разработаны амплификационные тест-системы, но наиболее ценным метод ПЦР оказался в диагностике вирусов гепатита В, С, D, G и TTV.

Общие характеристики вирусных гепатитов

Это обусловлено тем, что именно указанные возбудители больше всего ответственны за леталь­ные, хронические и неопластические исходы вирусных гепатитов у людей. В патогенезе ВГ решаю­щую роль играют свойства вируса и генетически детерминированный характер иммунного ответа на этот возбудитель, поэтому не менее важна оценка иммунитета (определение CD-4, CD-8, CD-56 и других фенотипов, уровня интерферонов). Как указывалось выше, наиболее точные оценки иммунно­го статуса получаются при использовании метода проточной цитофлюориметрии. Общая характери­стика вирусных гепатитов приведена в таблице 2.

Вирус простого герпеса I и II типов (ВПГ1+2)

Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых ВПГ 1+2 типов, включает в себя комплекс исследований, состоящий из выявления специфического иммунного ответа (антител), определения вирусной ДНК и вирусных белков (антигенов), а также подтверждение природы патогена культу-ральным методом (по цитопатогенному эффекту вируса в перевиваемой культуре клеток).

Серологические тесты на ВПГ, направленные на выявление антител против ВПГ 1+2, показали низкую диагностическую значимость из-за неоднозначности клинической трактовки. Это обусловле­но тем, что у 97-100 % обследованных клинически здоровых лиц обнаруживались указанные антите­ла. Нарастание титров антител к ВПГ происходит медленно, в течение нескольких недель, при этом могут одновременно определяться специфические антитела класса М и G. Впоследствии антитела к ВПГ класса М могут циркулировать в крови в некоторых случаях от нескольких месяцев до несколь­ких лет. Этот феномен связывают с нарушением иммунитета у инфицированных ВПГ лиц. Кроме то­го, в случае реактивации ВПГ в крови могут вновь появиться специфические антитела класса М. С другой стороны, у иммуноскомпроментированных пациентов при рецидивах инфекции ВПГ анти­тела к вирусу (как IgM, так и IgG) могут не выявляться. Ложноотрицательный ответ на анти-ВПГ класса М может быть у новорождённых. Все перечисленное выше показывает затруднительность дифференцировки острой инфекции ВПГ от её реактивации. Тем не менее серологическое обследо­вание необходимо проводить, и делать это надо методом «парных» сывороток (с интервалом 14-21 день). Так, например, отсутствие в первой и появление во второй сыворотке противогерпетических IgM или нарастание титров специфических IgG в 4 раза и более может быть показателем острой ин­фекции ВПГ. Таким образом, серологические тесты на наличие антител к ВПГ не могут служить единственным и надёжным критерием в постановке клинического диагноза.

Метод ПЦР в настоящее время является основным диагностическим способом в практическом здравоохранении для выявления ДНК вируса. При этом для выделения ДНК ВПГ может быть исполь­зован любой биологический материал: клетки, биологические жидкости, ткани и т.п. В настоящее время разработаны методы количественного определения вирусной ДНК в тестируемом образце. На основании полученных данных можно оценить форму инфекционного процесса. Так, если количест­во ДНК превышает 1000 копий геном-эквивалента (г/э) на 10 лейкоцитов периферической крови, это может свидетельствовать о развитии диссеминированной инфекции.

Цитомегаловирус (ЦМВ)

ЦМВ может быть причиной многих серьёзных заболеваний с летальным исходом. Темпы роста заражения ЦМВ составляют 1 % в год, при этом к пятидесятилетнему возрасту инфицированность людей приближается к 100 % показателю. Эти факты не позволяют однозначно ответить на вопрос о степени патогенности вируса. С одной стороны, ЦМВ редко вызывает клинически манифестные за­болевания у иммунокомпетентных людей. С другой стороны, у иммунодефицитных пациентов отме­чено развитие таких ЦМВ-обусловленных заболеваний, как мононуклеоз (гетерофильнонегативный вариант), хориоретинит, ретардация ментальных функций, глухота и т.п. Как и любая другая герпе­тическая инфекция, при первичном инфицировании ЦМВ возникает пожизненная латенция. Реакти­вация ЦМВ-инфекции зависит от состояния иммунной системы организма, срыв которой приводит к возможности патологического влияния вируса на организм.

Лабораторная диагностика ЦМВ-инфекции включает в себя несколько подходов:

  • выявление инфекционных вирусных частиц или антигенов;
  • определение вирусной ДНК;
  • определение иммунного ответа организма;
  • выявление прямого цитопатического действия вируса, выделенного из биологических суб­стратов пациента, на перевиваемую культуру клеток.

Серологические тесты на ЦМВ являются основными для установления инфицирования данным вирусом. Однако это отнюдь не является основанием для заключения о том, что болезнь действи­тельно вызвана ЦМВ. Показано, что высокие титры анти-ЦМВ-антител обнаружены как у здоровых носителей, так и у больных с острым течением инфекции. Селективное определение специфических антител против ЦМВ класса М и G также не позволяет с полной уверенностью дифференцировать острую инфекцию от реактивации хронической. Поэтому определение вирусных антигенов и ДНК ЦМВ становится важным тестом для диагностики заболевания этим вирусом.

Метод ПЦР широко используется для диагностики ЦМВ в любых биологических тканях и жид­костях, в том числе и биопсийном материале, фиксированном формалином. Этот метод превышает по своей чувствительности все имеющиеся аналоги. Для увеличения диагностической и прогностиче­ской значимости разрабатываются количественные методы исследования, создаются праймеры к сверхранним, ранним и поздним генам вируса. Кроме того, апробируются новые технологии ПЦР, основанные на определении РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Это позволит выявлять мРНК репли­цирующегося ЦМВ. Во многих работах показано, что прямая детекция ДНК ЦМВ в плазме методом ПЦР коррелирует с повышенным риском развития манифестной формы ЦМВ или связанными с ней осложнениями. Кроме того, определение вирусной нагрузки ЦМВ в крови позволяет оценить эффек­тивность противовирусной терапии [17].

Папилломавирусная инфекция человека

Согласно пресс-релизу Всемирной организации здравоохранения от 03.06.96 г. во всем мире от­мечается рост заболеваемости папилломавирусными инфекциями (HPV — от англ. Human Papilloma­viruses Установлено, что ВПЧ-инфекция — высокораспространенное заболевание, передаваемое по­ловым путем. Обширные эпидемиологические исследования проводятся в разных странах [18-20].

Согласно данным эпидемиологических исследований встречаемость ВПЧ значительно варьирует в различных этнико-географических регионах. Распространенность ВПЧ во многом определяется соци­ально-экономическими, поведенческими, медико-гигиеническими условиями. Минимальная зареги­стрированная частота инфицированности ВПЧ (5 %) наблюдается в Испании. Эта страна принадле­жит к странам с «низким» риском заболевания раком шейки матки. Наибольший уровень инфициро­вания наблюдается в Аргентине и Гондурасе и приближается к 40 % от всего обследованного контин­гента.

HPV-инфекцию начали интенсивно изучать после установления доказательств роли данного ви­руса в возникновении опухолей аногенитальной области, в частности, рака шейки матки.

HPV — мелкие ДНК-вирусы, особенностью которых является пролиферативное влияние на эпи-телиоциты кожи и наружных слизистых. В настоящее время известно около 100 типов HPV, разли­чаемых онкогенными свойствами. К группе высокого онкопотенциала относят следующие типы ви­русов папилломы: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. К типам с низкими предиктами онко-генности относят варианты: 6, 11, 42, 43 и 44. Что же касается частоты встречаемости типов ВПЧ, то среди здоровых женщин наиболее часто встречается ВПЧ типа 16, в 1,5-2 раза реже выявляется ВПЧ типа 18. Суммарно на долю этих двух типов приходится 45 % от общего числа выявляемых типов ВПЧ. В лабораторной диагностике НРV-инфекции применяются исключительно молекулярно-генетические методы анализа. Использование метода ПЦР для выявления папилломатоза резко по­вышает уровень доклинической диагностики предраковых состояний благодаря высочайшей чувст­вительности и предсказательной ценности типирования вируса. Проведенные эпидемиологические исследования в Европе и Северной Америке показали, что при всех формах инвазивного рака матки у 70 % женщин старше 35 лет с дисплазией клеток эпителия матки был выявлен вирус папилломы пре­имущественно 16 и 18 типов. У женщин с нормальной цитологией НРV обнаруживался только в 3,5 % обследованных [21].

Применение ПЦР для диагностики наследственных заболеваний

В патогенезе наследственных болезней лежат аномалии наследственного аппарата (генома) клет­ки. Данные повреждения могут затрагивать весь геном или только отдельные хромосомы клетки. В свя­зи с этим могут возникать хромосомные или генные болезни. По данным генетического мониторинга в странах Восточной Европы нарушения генома разной степени встречаются у 1,5-2 % всех новорож­денных, что влияет на показатели здоровья детского населения. Методы молекулярной диагностики в своей сути явились продуктом исследований в области устройства генома клетки человека [22].

В настоящее время ПЦР является основным диагностическим средством в клинической практике генетика. С помощью ПЦР можно определять локализацию предполагаемых мутаций или полиморф­ных сайтов в ДНК клетки. Разработаны и практически применяются варианты автоматического поис­ка последовательностей ДНК, использование которых оптимизирует амплификацию необходимого участка ДНК. В качестве источника матричной ДНК может использоваться любой биологический материал (даже деструктурированный), сохранивший в своем составе определённую часть нуклео-тидной последовательности. Существует множество модификаций ПЦР для медико-генетического анализа, применение которых зависит от целей и характера исследований. Самым главным достоин­ством ПЦР для медико-генетической диагностики является универсальность, позволяющая прово­дить исследования на любой стадии онтогенеза индивидуума, в том числе и в пренатальном периоде. В диагностике генетических болезней имеют место два подхода:

  • прямая диагностика, основанная на непосредственной идентификации мутации в определён­ном гене;
  • косвенная (непрямая) диагностика, основанная на маркировании мутантного гена с помощью молекулярных маркеров.

Прямая диагностика основана на определении мутации в самом гене. Этим создается высокая точность исследования (98-100 %) и возможность пренатальной диагностики в семье и выявления гетерозиготных носителей при отсутствии больного ребёнка. Непрямой, или косвенный, подход яв­ляется более универсальным и распространённым. Его суть лежит в анализе внутри- и внегенных по­лиморфных сайтов. Главное достоинство косвенного метода — возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутации в самом гене, даже при отсутствии данных о точной идентификации мутантного гена. Недостатком этого метода является необходимость наличия в семье больного ре­бёнка или возможность исследования «архивной» ДНК в случае его гибели. Кроме того, имеется более высокий процент ошибки, обусловленный переносом полиморфного сайта на здоровый аллель вследствие кроссинговера.

В настоящее время можно осуществлять пренатальную клиническую диагностику методом ПЦР следующих моногенных заболеваний: гемофилия А и В, миодистрофия Дюшена/Беккера, болезни Хантера и Леш-Нихана, агаммаглобулинемия, муковисцидоз, фенилкетонурия, синдромы Альпорта и Шарко-Мари-Тус, болезнь Коновалова-Вильсона и дефицит альфа-1-антитрепсина и т.п. [23-24].

Применение ПЦР для диагностики онкологических заболеваний

Онкологическая заболеваемость является одной из основных причин смертности, особенно сре­ди населения стран СНГ, подвергшихся воздействию последствий Чернобыльской катастрофы, — государств с высоким возрастным цензом населения. Концептуальное положение «опухоль — это патология генов» во многом определило стратегию диагностики и лечения новообразований. Опре­деление понятий «канцероген», «протоонкоген» и «антионкоген», в сочетании с открытием и внедре­нием в клиническую практику метода ПЦР, послужило решительным толчком в области диагностики и лечения новообразований. Тестирование молекулярно-генетических онкомаркеров предполагает выявление дефектов структуры и функциональную активность НК протоонкогенов, антионкогенов и биологических канцерогенов (вирусов). Наиболее приемлемым способом точно и быстро определять аномальные ДНК является ПЦР. Высокая чувствительность метода позволяет определять аномаль­ную ДНК в ничтожно малых количествах (десятки, сотни копий агента), что означает выявление не­опластических клеток на доклинической стадии опухолевого процесса.

Теоретической предпосылкой генодиагностики рака является то обстоятельство, что канцероге­нез есть результат накопления в соматических клетках мутаций ряда функционально важных генов, участвующих в клеточной пролиферации, апоптозе, репарации ДНК и др. В силу этого обнаружение в биологических средах организма мутантных генов (т.е. специфическим образом измененных нук-леотидных последовательностей ДНК) свидетельствует о присутствии в организме трансформиро­ванных клеток. За последнее десятилетие было выявлено более сотни генов, ответственных за гене­зис различных онкозаболеваний; мутации в этих генах идентифицированы, а генетические пути, в рамках которых эти гены действуют, охарактеризованы [25]. Общепризнано, что от 3 до 8 последова­тельных генетических повреждений в делящейся соматической клетке могут привести к ее озлокаче-ствлению и к запуску процесса образования опухоли [26].

В соответствии с двумя типами дефектов, лежащих в основе канцерогенеза, известные сегодня ДНК-маркеры являются либо генетическими, сопряженными с изменением нуклеотидной последова­тельности ДНК, либо эпигенетическими, обусловленными аберрантным метилированием определен­ных последовательностей ДНК. Обнаружение в биологических средах таких специфическим образом измененных или модифицированных последовательностей указывает на присутствие в организме опухоли.

К генетическим дефектам относятся мутации, делеции и вставки, которые могут быть локализо­ваны как в ядерной, так и в митохондриальной ДНК, в составе как структурных генов, так и некоди-рующих микросателлитных последовательностей. Наиболее частым объектом анализа являются так­же мутации онкогенов (например, К-RAS) или генов-супрессоров опухолевого роста (в частности, ТР53, АРС и др.).

К эпигенетическим изменениям относится метилирование остатков цитозина в регуляторных участках генов-супрессоров. Являясь важным физиологическим процессом, лежащим, в частности, в основе феномена генетического импринтинга, метилирование ДНК становится существенным факто­ром канцерогенеза в том случае, когда оно распространяется за пределы четко определенных генети­ческих «территорий».

Опухолевые клетки и содержащиеся в них ДНК можно выявлять на удалении от основного оча­га. При обнаружении специфических мутаций в ДНК естественных выделений можно подозревать опухоль соответствующего органа. Этот подход весьма эффективен в случае опухолей мочевого пу­зыря, толстой кишки, легких и бронхов, поджелудочной железы [27].

Основные направления использования ПЦР в онкологической патологии включают:

  • ДНК-диагностику наследственных форм рака;
  • ДНК-диагностику спорадических форм рака;
  • определение микрометастазов;
  • ДНК-диагностику биологических канцерогенов (HPV 16 и 18 типов, ВЭБ-инфекции,HBV и HCV, ретровирусы и т.п.);
  • доклиническую диагностику опухолей (определения протоонкогенов и антионкогенов);
  • прогноз заболевания и успешности назначаемой терапии, а также эффективность проведенного лечения на основе диагностики функциональной активности онкогенов;
  • исследование «архивных» биоптатов с установленным клинико-гистологическим диагнозом. Это важно в оценке диагностической значимости предполагаемого маркера и правильности те­рапии.

Использование метода ПЦР в практической онкологии даст ценную научную и клиническую информацию врачу, что значительно улучшит качество диагностики.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. При­чины этого отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того чтобы определить, какой разновидностью цитохро-ма обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Та­кой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping) [28].

 

 

Список литературы

  1. ФедоровН.А. Генодиагностика инфекции методом ПЦР // Педиатрия. — 1995. — № 4. — С. 69-70.
  2. ГликБ., ПастернакДж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
  3. medlab.scn.ru
  4. Жданов А.В., Малинина Э.В., Файзуллин Л.З. и др. Выявление хламидий методом полимеразной цепной реакции при патологиях репродуктивной системы мужчин и женщин // Бюллетень экспериментальной биологии. — 1996. — № 5. —С. 547-550.
  5. Тихонова Л.И. Общий обзор ситуации с инфекциями, передаваемыми половым путем // Современные методы диаг­ностики, терапии и профилактики инфекций, передаваемых половым путем, и других урогенитальных инфекций: Материа­лы рабочего совещания дерматовенерологов и акушеров-гинекологов. — М., 1999. — С. 2-3.
  6. Black C.M. Current methods of laboratory diagnoses of Clamydia trachomatis infections // Clin. Microbiol Rev. — 1997. —№ 10. — Р. 160-184.
  7. med-expert.ru
  8. medsan.ru
  9. Овчинников Н.М., Беднова В.Б., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. — М.: Медицина, 1987. — 273c.
  10. Ракольская И.В., Вульфович Ю.В. Урогенитальные микоплазмозы: Обзорная информация. — М., 1990. — 437 с.
  11. Bauwens J.E., ClarkM., Stamm W.E. Diagnosis of Chlamydia Trachomatis endocervical infections by a commercial polymerase chain reaction assay // Clinical microbiology. — 1993. — Vol. 31. — № 11. — P. 3023-3027.
  12. Blanchard A. et al. Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adult, amniotic fluid and in the respiratory tract // Clinical infectional diseases. — 1993. — Vol. 17. — № 8. — P. 148-153.
  13. Jaschek G., Gaydos C.A., Welsh L.E., Quinn T.S. Direct detection of Clamydia trachomatis in urine speciments from symptomatic and asymptomatic men by using a rapid polymerase chain reaction assay // Clinical microbiology. — 1993. — Vol. 31.№ 5. — Р. 1209-1212.
  14. Погосян Г.П., Ли К.Г., Жумина А.Г. Изучение амплификации ДНК некоторых бактериальных агентов, вызывающих урогенитальные заболевания // Повышение качества образования и научных исследований: Материалы междунар. науч.-практ. конф. в рамкахVI Сатпаевских чтений (12-14 апреля 2007 г.). — Экибастуз: Изд-во ЕИТИ, 2007. — С. 744-749.
  15. Скворцов С.В., Найденов Ю.Н. и др. Диагностика хламидиоза и урогенитальных микоплазмозов при помощи цепной полимеразной реакции // Военно-медицинский журнал. — 1995. — № 7. — С. 49-50.
  16. КиселевВ.И., ЛатыповаМ.Ф. и др. Полимеразная цепная реакция в качестве критерия излеченности урогенитально-го хламидиоза // Вестник дерматологии и венерологии. — 2001. — № 4. — С. 4-5.
  17. dialab.dp.ua
  18. Boone C.W., Kelloff G.J. Endpoint markers for clinical trails of chemopreventive agents derived from the properties of epithelial precancer measured by computer-assisted image analysis // Cancer Survey. — 1998. — 32. — P. 133-147.
  19. McCree D.H. et al. National survey by specialty of US physicians' HPV screening practices // Prevmed. — 20 — № 36.
  20. Р. 159-163.
  21. Sherman M.E., Lorinoz A.T., ScotD.R. et al. Baseline cytology, human papillomavirus testing and risk for cervical neoplasia: a 10-year cohort analysis // Natl. Cancer Inst. — 2003. — № 95. — Р. 46-52.
  22. Кубанов А.А. Современные методы диагностики вируса папилломы человека // Вестник дерматологии и венероло­гии. — 2005. — № 1. —C. 26-35.
  23. Баев А.А. Программа «Геном человека», ее возникновение, содержание и развитие // Итоги науки и техники: геном человека. — 1990. — Т. 1. — С. 4-33.
  24. Баранов В.С. Ранняя диагностика наследственных болезней в России (современное состояние и перспективы) // Ме­ждународные медобзоры. — 1994. — Т. 2. — № 4. — С. 236-243.
  25. БарановВ.С., Гинтер Е.К. Генетические аспекты муковисцидоза. — М.: Медицина, 1995. — 90 с.
  26. Ланцов В.А., Вострюхина О.А. Диагностика злокачественных опухолей толстой кишки с помощью молекулярно-генетического анализа фекальной ДНК // Вопросы онкологии. — 2005. — Т. 51. — № 2. — С. 167-172.
  27. de Kok T.M., van Maanen J.M. Evaluation of fecal mutagenicity and colorectal cancer risk// Mutat Res. — 2000. —— Р. 53-101.
  28. Golijow C.D., Mouron S.A. et al. Differences in K-ras codon 12 mutation frequency between «high risk» and «low-risk» HPV-infected samples// Gynecol. Oncology. — 1999. — 75. — Р. 108-112.org.ru.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.