Применение микробиологического теста Эймса для определения мутагенных свойств производных тиазола и бензотиазола

Отмечено, что современная наука формирует условия для поиска и создания новых фармакологиче­ских веществ, способных стать лекарственными препаратами, в связи с чем особый интерес представ­ляют различные производные тиазола и аминотиазола как вещества, обладающие широким спектром биологической активности. Показано, что химические вещества индуцируют мутации всех трех ти­пов: генные, хромосомные и геномные; универсального метода для их обнаружения не существует. В этой связи определено, что для изучения мутагенности используют несколько методов, позволяю­щих регистрировать индукцию различных категорий мутаций. Доказано, что тест Эймса является скрининговым методом, в котором в качестве индикатора мутагенности используются микроорганиз­мы; он позволяет быстро и недорого отобрать возможные мутагены.

Стремительное развитие фундаментальных наук формирует условия для создания новых фарма­кологических веществ, способных стать лекарственными препаратами. Новые источники получения потенциальных лекарственных средств значительно расширяют принципиальные возможности фар­макотерапии основных заболеваний человека. Между тем внедрение современных препаратов в кли­ническую практику осуществимо лишь при условии детального изучения их специфической фарма­кологической активности и безопасности на этапе экспериментальных исследований.

Исследование мутагенности новых фармакологических средств и вспомогательных компонентов лекарственных форм проводится на этапе доклинического изучения безопасности их применения. Эта работа предусматривает оценку способности лекарственных средств к индукции разных типов мутаций в зародышевых и соматических клетках и делает необходимым использование для оценки мутагенных свойств лекарств комплекса методов, выполняемых на различных тест-объектах [1].

Химические вещества индуцируют мутации всех трех типов: генные, хромосомные и геномные. Универсального метода для обнаружения всех типов мутаций не существует. В этой связи для изуче­ния мутагенности используют несколько методов, позволяющих регистрировать индукцию различ­ных категорий мутаций. К тому же изучение мутагенности на млекопитающих требует больших уси­лий, затрат и времени. Применение таких методов оправдано только при избирательном тестирова­нии, т. е. при установлении очередности.

Один из подходов к установлению этой очередности заключается в ступенчатой системе испы­таний, которая основывается на том, что фактически все генетически опасные вещества можно вы­явить с помощью простых или быстрых методов скрининга (просеивания). К скрининговым тест-системам относятся методы, в которых в качестве индикатора мутагенности используются микроор­ганизмы. Мутагены, обнаруженные при скрининге, подвергают всестороннему исследованию на тест-системах, позволяющих учитывать индукцию генетических нарушений в клетках млекопитаю­щих in vitro и in vivo.

В настоящее время разработано несколько тестов для определения мутагенной активности раз­личных веществ. Наиболее оптимальным из них является тест Эймса, не требующий больших мате­риальных и временных затрат. Это — генетический тест с использованием бактерий Salmonella Typhimurium в качестве тест-объекта [1], предназначенный для оценки мутагенного потенциала хи­мических соединений. Положительный результат в тесте означает, что химическое вещество может обладать канцерогенными свойствами. Так как малигнизация часто связана с повреждением ДНК, тест также используется как экспрессный метод оценки канцерогенного потенциала различных хи­мических соединений и как дополнение другого аналогичного метода — стандартного теста на гры­зунах [1]. Методика была описана в ряде работ в начале 1970-х Брюсом Эймсом и его группой в Ка­лифорнийском университете Беркли.

Тест Эймса является одним из основных методов в скрининговых программах различных стран, когда нужно сравнительно быстро проанализировать большое число соединений и отобрать среди них те, которые потенциально могут явиться мутагенами для человека. Такое широкое применение этого метода связано с высокой корреляцией между канцерогенной и мутагенной активностями хи­мических веществ [1, 2].

Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и/или их метаболи­тов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма.

Мутагены, индуцирующие замены пар оснований, — агенты, вызывающие мутации типа замены пар оснований в молекуле ДНК. В данном тесте эти мутации могут происходить или в сайте исход­ной мутации или в другом сайте хромосомы.

Мутагены, индуцирующие мутации типа сдвига рамки считывания, — агенты, вызывающие вставку или делецию одной или нескольких пар оснований в молекуле ДНК.

Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium.

Фармакологические средства с выраженной антибактериальной активностью изучать в тесте Эймса нецелесообразно, так как это приведет к гибели тест-объектов.

Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации или без нее. После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ре-вертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертан-тов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные рас­творителем).

Если тестируемое соединение и/или его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксо-трофности к прототрофности по гистидину у гисти-динзависимых штаммов Salmonella typhimurium [1]. Схема постановки эксперимента приведена на рисунке.

В расплавленный полужидкий голодный агар вносят при 43-45° 0,1 мл суспензии бактерий ин­дикаторного штамма (2-108 клеток), 0,1 мл раствора испытуемого вещества в необходимой концен­трации и 0,5 мл активирующей смеси. Содержимое пробирки перемешивают и быстро наслаивают на нижний селективный агар. Чашки инкубируют при 37° в течение 48 часов и учитывают количество колоний- ревертантов от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Если вещество проявляет мутагенную активность, то количество ревертантов на опытных чашках превышает количество ре-вертантов в контроле [1-3].

В качестве тестерных организмов используются штаммы Salmonella typhimurium. Минимальный набор состоит из штаммов ТА 97, ТА 98 и ТА 100. При необходимости могут использоваться и дру­гие виды и штаммы микрорганизмов.

Каждый штамм должен быть проверен на ауксотрофность по гистидину, чувствительность к кристаллическому фиолетовому и устойчивость к ампициллину, поскольку эти штаммы содержат плазмиду ркМ101, кодирующую устойчивость к ампициллину. Тестерные штаммы должны иметь уровень спонтанных ревертантов в пределах ожидаемого на основании литературных данных.

Характеристика индикаторных штаммов Salmonella typhimurium приведена в таблице. Все штаммы являются производными лабораторного штамма Salmonella typhimurium LT-2, от которого под действием различных мутагенных агентов были получены ауксотрофные по гистидину мутанты G-46, C-207, C-3076 и D-3052. Первый мутант имеет мутацию замены оснований в C-гене гистидино-вого оперона и ревертирует к прототрофности под действием мутагенов, вызывающих соответствен­но мутации замены пар оснований. Остальные мутанты несут мутации типа сдвига считывания в C (C-207 и C-3076) и D ф-3952)-генах и ревертируют только под действием мутагенов, вызывающих этот тип мутаций [1-4].

Таблица демонстрирует тип мутаций в штаммах, а также их отношение к ауксотрофности по гистидину. Для повышения чувствительности этих мутантов к действию мутагенов в геном инди­каторных бактерий были внесены дополнительные мутации, которые позволили получить широко используемые в настоящее время штаммы. Делеция galbiouvrB захватывает биотиновый оперон, часть галактозного оперона и ген uvrB. Последний дефект вызывает нарушение системы эксцизион-ной репарации, что еще более повышает чувствительность тестерных штаммов к действию ряда му­тагенов. Мутация rfa увеличивает проницаемость клеточной стенки вследствие дефектов в полисахаридном слое.

Широкое применение нашли штаммы, несущие плазмиду pKM 101. Новые штаммы TA 100 и TA 98, полученные путем передачи этой плазмиды соответственно в штаммы TA 1535 и TA 1538, оказа­лись более чувствительными к действию ряда веществ, чем исходные бесплазмидные штаммы.

Для составления активирующей смеси обычно берут S-9 фракцию, НАДФ и глюкозо-6-фосфат. Последние представляют собой НАДФН-генерирующую систему: НАДФН служит в качестве донора электронов, который переносится на цитохром Р-450.

В работе используют S-9 печени крыс, которым предварительно вводили индукторы микросом. В качестве индукторов применяют фенобарбитал, 3-метилхолантрен, полихлорированные бифенилы арохлор 1254 или совол [5].

Дальнейшее повышение чувствительности теста Эймса идет за счет конструирования новых штаммов. Известно, что тестерные штаммы S.typhimurium позволяют обнаружить не только мутаген­ную активность, но и устанавливать вероятные механизмы мутагенного действия, изучать зависи­мость активности от их химической структуры и метаболизм определенных групп соединений в бак­териальной клетке. Все стало возможным в результате постоянного совершенствования тестерных штаммов путем введения новых мутаций, выгодно отличающих их от исходных. В настоящее время используют штаммы TA 1535, TA 100, TA 102, регистрирующие мутации типа замены пар основа­ний, TA 1538, TA 97 и TA 98 — мутации типа сдвига рамки считывания.

В отличие от других тестерных штаммов штаммы TA 102, TA 104 и TA 96 содержат в сайте му­тации пары A-T. Первые 2 штамма имеют охра-мутацию hisG 428 и регистрируют мутации типа за­мены пар оснований (TA — ЦГ).

При создании штамма TA 102 использован новый подход [1-3]. Часть гистидинового оперона, содержащего аллель hisG 428, была введена в мультикопийную плазмиду pBR322. Полученная таким образом плазмида pG1 была перенесена в бактерии с делецией гена hisG. В клетках штамма TA 102 содержится до 30 копий pAQ1 и 7-8 копий плазмиды pKM101. Увеличение дозы гена-мишени приве­ло к увеличению чувствительности данного штамма в среднем в 5-12 раз по сравнению с изогенным штаммом, содержащим одну копию аллеля hisG 428 в хромосоме. Использование штамма TA 102 по­зволяет выявлять мутагенную активность гидроперекисей, перекиси водорода, хинонов, фенилгидра-зина, различных альдегидов и агентов, индуцирующих повреждение тимина (УФ, блеомицин).

Имеются попытки совмещения в одном тестерном штамме способности регистрировать как му­тации сдвига рамки считывания, так и мутации типа замены пар оснований. Так, например, путем скрещивания штамма S.typhimurium TA 1535 со штаммом E.coli AG 249 сконструирован новый штамм E.coli AQ 262, содержащий в своем геноме 2 ауксотрофные мутации — hisG 46 и arg-2 [8]. Первая из них позволяет тестировать вещества, индуцирующие мутации в результате замены пар ос­нований, вторая — выявлять способность к индукции мутаций типа сдвига рамки считывания [4-8].

Фармацевтический рынок Казахстана, по некоторым данным, насчитывает более 7000 наимено­ваний лекарственных средств. Однако только около 10 % от этого числа составляют препараты оте­чественного происхождения. В последнее время казахстанцы все чаще критикуют качество прода­ваемых в стране лекарственных препаратов. Некоторые из лекарств вообще не помогают улучшить состояние, но при этом стоят очень дорого. Кроме того, многие медикаменты имеют массу побочных эффектов, небезопасных для здоровья. Улучшения качества, а также снижение стоимости разрабаты­ваемых и производимых лекарственных препаратов, предлагаемых населению, — сегодня важнейшие задачи для Республики Казахстан [9].

В связи с быстрыми темпами развития фармакологической науки во всем мире значительно уве­личился интерес к органической химии как основному источнику биологически активных веществ, так как не все необходимые потенциальные лекарственные формы можно извлечь из природного сы­рья. Практически можно сказать, что человека на протяжении всей его жизни окружает химия в сво­их различных проявлениях, причем все процессы в его организме протекают по законам органиче­ской и биоорганической химии.

Особый интерес представляет химия гетероциклических соединений, т.е. имеющих в своем со­ставе кроме атома углерода другие атомы периодической системы Менделеева. Это связано с целым рядом особых свойств, проявляющихся у подобных веществ. К данным свойствам можно отнести различные виды фунгицидной, акарицидной фармакологической активности, новые оптические свой­ства получаемых органических соединений, возможность их применения во многих отраслях челове­ческой деятельности. 2-Аминобензотиазолы и продукты их превращений обладают широким спек­тром биологической активности. Синтезу, исследованиям реакционной способности и фармакологи­ческих свойств этого класса веществ посвящено большое количество публикаций. В последнее время их число значительно возросло, так как среди 2-аминобензотиазолов и продуктов их химических пре­вращений выявлены перспективные лекарственные субстанции, некоторые из которых внедрены в медицинскую практику [10].

Гетероциклические ароматические амины играют важную роль в живой и неживой природе. Они участвуют в процессах жизнедеятельности как активные фрагменты природных соединений, находят широкое применение в производстве синтетических лекарственных препаратов, искусственных кра­сителей, пластических масс, гербицидов, ядохимикатов.

Химическая активность гетероциклических ароматических аминов существенно зависит от при­роды, положения и числа гетероатомов в ароматическом кольце. Межмолекулярные взаимодействия ароматических аминов во многом определяются механизмом водородной связи, поэтому исследова­ние особенностей этого механизма представляется актуальным.

Создание и химическая модификация новых производных тиазола и 2-аминобензотиазола фосфорорганическими соединениями является оправданным в прикладном и теоретическом плане науч­ным исследованием. Введение в молекулу гетероциклического амина атома фосфора делает эти со­единения уникальными синтонами для получения разнообразных классов ФОС с практически полез­ными свойствами. Не менее интересно и введение фосфорнокислого остатка, так как последний обу­словливает наличие у соединений комплексообразующих свойств и возможность проявления значи­тельных фармакологических эффектов, например: противовоспалительного, жаропонижающего, анальгетического, противоартритного и мн. др. [11, 12].

Интерес к фосфорорганическим соединениям определился их многообразием и уникальным на­бором свойств, делающих эти вещества ценными объектами теоретических исследований и придаю­щих им большую практическую значимость. Наиболее известной сферой использования фосфорорга-нических соединений является защита сельскохозяйственных растений и животных от вредителей и болезней.

Среди приемов структурной модификации 2-аминобензотиазольного фармакофора особое место занимает получение разнообразных производных по аминогруппе. В случае введения в молекулу 2-аминобензотиазола остатка дикарбоновых кислот, входящих в цикл Кребса и являющихся естест­венными метаболитами, удается существенно понизить токсичность соединений и, как правило, уве­личить величину биоэффектов. Другим методом конструирования биологически активных соединений на основе 2-аминобензотиазола является синтез гетероаннелированных производных, в которых оста­ток указанного гетероцикла включен в структуру конденсированной гетероциклической системы [13].

Значительные успехи в практическом использовании и важная роль, которую выполняют фос-форилированные производные 2-аминотиазола и 2-аминобензотиазола в процессах жизнедеятельно­сти, являются основой большого и неугасающего интереса к химии этих соединений. С целью оценки современного состояния данного направления исследования нами проведен информационный поиск. Так, сведения о синтезе строении и биологической активности фосфорилированных тиазолов широко представлены в работах отечественных и зарубежных авторов [10-13].

Тестирование на мутагенность указанных химических веществ, обладающих потенциальными биологически активными свойствами, необходимо для выявления возможных негативных последст­вий. Метод Эймса является наиболее подходящим для определения мутагенной активности произ­водных тиазола и бензотиазола. 

References

1. Harbiyev R. U. Guide to experimental (prior clinical) studying of new pharmacological substances. — Moscow: JSC Me-ditsina Publishing House, — 832 p.
2. Guskova T.A. An assessment of safety of medicines at the stage of prior clinical studying // the Chemical and pharmaceutical magazine. — 1990. — № 7. — 10-15.
3. Assessment of a mutagenicity of new medicines: Methodical recommendations. — Moscow, 1994. — 20 p.
4. Mortelmans K., ZeigerE. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity test // Mutat. Res., — Vol. 455. — P. 29-60.
5. Belitsky G.A., Fonstein L.M., Hudoley V.V. et al. Sovol as inductor of microsomia enzymes, activating pro-carcinogens // Ex­perimental oncology. — 1987. — 9. — № of Zyu. — P. 20-23.
6. Methods of primary detection of the genetic activity of pollutants of the environment by means of bacterial test systems: Me­thodical instructions. — Moscow, 1985. — 34 p.
7. The guide to short-term tests for identification of mutagen and cancerogenic chemicals. Hygienic criteria of a state of envi­ronment — Geneva: WHO, 1989. — 212 p.
8. Maron D.M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test//Mutat. Res. — 1983. — 113. — № 3-1. — P. 173-215.
9. Dzhilkrist T. Chemistry of heterocyclic connections. — Moscow: Mir, — 464 p.
10. Ivansky V.I Chemistry of heterocyclic connections. — Moscow: Vysshaya shkola, — 560 p.
11. Drach B.C., Lobanov O.P. New synthesis of phosphorilizated tiazoles. — General Chemistry Journal. — 1978. — 48. — № 9. — P. 1994-1997.
12. Grapov A.F., Aripov A., Galushina B.B, Supin G.S. Chemistry of organic elements conne — Leningrad: Nauka, 1976. — 105 p.
13. Turan-Zitouni G., Demirayak S., Ozdemir A., Kaplancikli Z.A., YildizM.T. Synthesis of some 2- (Benzazole — 2-yl) thioace-tylamino thiazole derivatives and their antimicrobal activity and toxicity // Eur. J.Med. Chem. — Vol. 39. — P. 267-272.